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1α,25-二羟维生素 D3[1α,25-dihydroxyvitamin D3,1α,25-(OH)2D3]是维生素 D(Vitamin D,Vit D)主要活性形式,广泛参与多种细胞的发育、分化、生长和调节。破骨细胞(osteoclast,OC)能够溶解骨骼,释放钙离子至血液,不仅能够维持骨稳态,还能调节机体钙稳态。课题组前期研究表明1α,25-(OH)2D3对OC分化存在调控作用,差异蛋白质组学结果表明,OC除受经典的核因子κB受体活化因子配体(Receptor activator for nuclear factor-κB ligand,RANKL)/核因子κB 受体活化因子(Receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)/骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)调节轴调控外,还受到半乳糖凝集素-3(Galectin-3,Gal-3)的调控,但具体的调控作用及机制还不清楚。本研究拟采用骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)和骨髓巨噬单核细胞(Bone marrow mononuclear macrophage,BMMs)共培养建立鸡体外 OC培养模型,观察1α,25-(OH)2D3对鸡OC分化和功能的影响;敲低或过表达BMSCs中Gal-3后,观察Gal-3在1α,25-(OH)2D3调控鸡OC分化中的作用及机制,为临床禽类骨骼和钙离子代谢紊乱性疾病研究提供理论依据。1.1α,25-(OH)2D3对鸡OC分化的影响为探究1α,25-(OH)2D3对鸡共培养体系OC分化的影响,本研究通过TRAP染色、qRT-PCR、Western blot、ELISA、骨吸收活性鉴定等检测方法,观察OC数目、标志基因、标志蛋白、分泌型蛋白表达水平及骨吸收活性。结果显示,BMSCs:BMMs以1:100的共培养密度,同时加入10-8mol/L的1α,25-(OH)2D3,OC数目最多。10-8 mol/L 1α,25-(OH)2D3 培养 4-7 d,促进 OC 标志性分子CtsK、MMP-9、CAⅡ、TRAP mRNA和蛋白表达、促进OC分泌型蛋白(CtsK、MMP-9)表达、增强OC骨吸收活性。表明,1α,25-(OH)2D3能够促进鸡BMSCs与BMMs体外共培养体系中OC的分化和功能。2.1α,25-(OH)2D3对破骨细胞、骨髓基质细胞及骨髓单核巨噬细胞Galectin-3表达的影响为探究1α,25-(OH)2D3对鸡OC、BMSCs及BMMs中Gal-3的影响,本研究通过qRT-PCR、ELISA等检测方法,观察OC Gal-3 mRNA以及分泌性蛋白Gal-3的表达;BMSCs 中 Gal-3、RANKL和 OPG mRNA 及分泌型蛋白 Gal-3、RANKL 和 OPG 的表达;BMMs 中 Gal-3 mRNA 的表达。结果显示,1α,25-(OH)2D3 促进 OC mRNA和分泌型蛋白Gal-3的表达;促进BMSCs Gal-3、RANKL mRNA和分泌型蛋白Gal-3、RANKL的表达,抑制OPG mRNA和分泌型蛋白OPG的表达;促进BMMs Gal-3 mRNA表达。其中,1α,25-(OH)2D3对BMSCs调控作用最明显。表明,1α,25-(OH)2D3能够影响OC,BMSCs及BMMs中Gal-3的表达。3.Galectin-3在1α,25-(OH)2D3调控鸡破骨细胞分化中的作用为探究BMSCs中Gal-3在1α,25-(OH)2D3调控鸡OC分化中的作用,本研究干扰和过表达BMSCs中Gal-3后与BMMs共培养,通过TRAP染色、qRT-PCR、骨吸收活性鉴定等检测方法,观察OC数目、标志基因表达及骨吸收活性。结果显示,干扰Gal-3表达组OC分化受阻,骨吸收活性减弱;并且1 α,25-(OH)2D3促进OC分化、标志基因表达及骨吸收活性效应减弱。过表达Gal-3则促进OC分化、标志基因表达、抑制骨吸收活性。表明,Gal-3参与1α,25-(OH)2D3调控体外鸡OC分化及功能。4.Galectin-3影响维生素D调控鸡破骨细胞分化的机制为探究Gal-3在维生素D调控鸡OC分化中的分子机制,本研究通过对过表达或干扰Gal-3的BMSCs进行转录组测序分析。结果显示,干扰BMSCs中Gal-3的表达后307个基因显著上调,253个基因显著下调。过表达BMSCs中Gal-3后发生显著上调及下调的基因为214个及418个。差异表达基因KEGG分析发现,细胞因子受体相关通路、Ca2+信号通路和Wnt信号通路显著富集。通过qRT-PCR对富集通路中的基因进行验证,结果显示一氧化氮合酶(NOS2)、缓激肽B2受体(BDKRB2)、内皮素B受体(EDNRB)、BMP活化蛋白膜结合抑制剂(BAMBI)、DKK1和Wnt抑制因子(WIF1)基因与测序结果表达趋势一致,其中NOS2、BAMBI主要发挥催化活性和蛋白结合功能;BDKRB2、EDNRB主要参与跨膜信号传导和受体结合功能。提示,Gal-3可能通过上述靶基因的表达参与1α,25-(OH)2D3对体外鸡OC分化的调控。