家蚕是一种鳞翅目昆虫的模式生物,又是一种重要的经济昆虫,在我国拥有相当长的驯养历史。同时,家蚕又属于变态发育昆虫,在整个生活发育史中要经历卵、幼虫、蛹、成虫4个阶段,从幼虫到成虫的生长、发育等过程主要受到保幼激素(Juvenile hormone,JH)和蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)的调控。而保幼激素结合蛋白(juvenile hormone binding protein,JHBP)是JH在体内转运和发挥功能的载体,是Takeout/JHBP蛋白家族的一个总称。该家族蛋白都含有一个保守的JHBP结构域,同时在N端有两个Cys残基形成一个二硫键,连接于N末端和α1螺旋的第一个弯曲,被认为是该家族蛋白结合配体的核心部位。对于JHBP的研究,有利于进一步阐明家蚕的生长发育机理,也有利于蚕丝产业的发展。takeout(to)基因最早在果蝇中被发现,随后在其他昆虫中也发现了to基因的同源基因,而且该基因家族为昆虫特有。在家蚕中已鉴定出了几种to基因,发现其结构与其他昆虫的同源基因相类似,但目前对其功能的研究很少。在本研究中,我们通过SilkDB和NCBI数据库筛选出一个新的takeout like(tol)基因,并应用生物信息学分析、基因克隆、原核表达、Western Blot、激素处理等方法对家蚕体内Bmtol基因进行鉴定,并对其在家蚕体内的表达和功能进行探究,为深入研究JHBP在家蚕体生长、生殖、变态等发育中的作用提供理论支持。主要研究内容及结果如下:(1)家蚕Bmtol基因的克隆和生物信息学分析以家蚕大造品种5龄3天头部cDNA为模板,利用PCR扩增成功克隆出家蚕Bmtol基因。对家蚕Bmtol基因的序列进行生物信息学分析,该基因的开放阅读框ORF为759 bp,包含6个外显子和5个内含子,编码的氨基酸序列为252个氨基酸,其蛋白理论分子量为27.72 KD,等电点为6.16。该蛋白含有一段23个氨基酸序列的信号肽,并对其进行了细胞定位预测,发现该蛋白可能是分泌蛋白,亲疏水性预测结果显示该蛋白为亲水性蛋白。(2)家蚕Bmtol基因的原核表达、蛋白纯化及抗体制备由于家蚕Bmtol基因编码的蛋白序列在N端含有一段信号肽,为了能够成功表达出该蛋白,故选择非信号肽的区域进行原核表达载体的构建,表达载体为pET28(a),表达菌为E.coli BL21(DE3)。对重组工程菌蛋白表达条件及可溶性进行分析,最后确定28℃、IPTG浓度0.6 mM、诱导时间8 h为原核表达的最佳条件进行重组蛋白的大量表达。并对表达的重组蛋白进行Ni-NTA亲和层析,成功纯化出重组蛋白,对重组蛋白进行透析、浓缩得到纯度和含量都较高的重组蛋白。对浓缩后的重组蛋白制备多克隆抗体,并对抗体进行ELISA效价检测,发现抗体效价大于512,000,同时对抗体进行了特异性检测,发现其满足后续实验要求。(3)家蚕Bmtol基因的表达特征分析和功能初探应用RT-PCR和qPCR技术分析Bmtol基因在家蚕组织的表达特征,发现该基因主要在家蚕的的头部有较高的表达量,其次在表皮和精巢也有表达,而在其它组织中表达量很低或没有,这可能与家蚕个体发育和生殖发育的调控有关,主要作用机理还需要进一步的研究。通过RT-PCR检测中发现Bmtol主要在每个龄期的起蚕时表达量较高,从5龄3天到化蛹7天Bmtol基因的表达量较低,到化蛾后其表达量又开始上调,说明Bmtol基因除了参与幼虫生长发育的调控外,还可能参与化蛾后其它调控。利用Western Blot技术对BmTOL蛋白在家蚕各组织中的表达情况进行了分析,发现其检测结果与在核酸水平上的检测结果基本类似。基于前期实验结果,对家蚕进行激素处理,研究Bmtol基因在头部的表达情况,发现实验组与对照组差异不是很明显,而且随处理后时间的变化也没有太大的差异。可能与这个基因在5龄后期较低的表达有一定的关系。同时,又对处理的家蚕头部组织进行免疫组化实验,对其在头部组织进行定位和定性分析,结果也没有太明显的变化。