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背景:黑素瘤是来源于黑素细胞的恶性肿瘤,其恶性程度高,易侵袭转移。近年来,我国乃至全球的黑素瘤发病率呈逐年上升趋势。随着对黑素瘤发病机制认识的不断深入,肿瘤免疫治疗尤其是靶向免疫检查点分子的PD-1/PD-L1抗体已成为转移性黑素瘤治疗的首选方案之一。然而临床研究数据显示,约有60%～70%的患者在接受PD-1/PD-L1抗体治疗后无明显临床反应,且部分患者在长时间接受治疗后会出现治疗抵抗,严重限制了该免疫疗法在临床中的应用和治疗效果。因此,进一步深入研究黑素瘤发病及PD-1单抗治疗抵抗的具体机制,并据此开发新的治疗靶点及免疫联合治疗策略,已成为目前黑素瘤研究中亟待解决的关键问题。肿瘤-免疫细胞膜表面免疫检查点CTLA-4、PD-1、PD-L1等分子表达是介导包括黑素瘤在内的多种肿瘤免疫逃逸的重要机制。CD8+T细胞表面CTLA-4、PD-1分子可结合肿瘤细胞膜表面CD80、PD-L1等配体,引起CD8+T细胞异常激活至衰竭,失去抗肿瘤活性。然而,肿瘤细胞高表达免疫抑制分子不仅导致瘤团浸润功能性淋巴细胞异常衰竭,还对特定免疫治疗如PD-1单抗治疗等产生治疗抵抗。在PD-1单抗治疗后,瘤团浸润CD8+T细胞可通过分泌过量IFN-γ诱导黑素瘤细胞持续高表达PD-L1,削弱治疗效果,导致治疗抵抗。到目前为止,肿瘤PD-1/PD-L1抗体治疗抵抗的机制仍未完全阐明。进一步探究黑素瘤PD-L1的上游调控机制,探索特异性调控PD-L1的新靶点,开发联合免疫治疗新策略已成为目前肿瘤靶向免疫治疗研究的主要目标。泛素编辑酶A20（又称为TNFAIP3,肿瘤坏死因子诱导蛋白3）首先发现于血管内皮细胞,受肿瘤坏死因子刺激诱导调控。其两端的OTU域和锌指结构分别具有E3泛素连接酶和去泛素化酶作用。在免疫微环境中,A20可通过泛素编辑酶作用调控NF-κB、TRAF6、RIPK3等多条炎症信号通路,抑制细胞炎症介质的表达和释放,阻碍炎症反应进展,是免疫炎症调控的核心分子。现已证实A20对于免疫疾病和免疫细胞具有强大的调控能力,却鲜有研究探讨A20在肿瘤免疫中的作用及机制。最新研究发现,瘤团浸润CD8+T细胞内的A20能够抑制CD8+T细胞抗肿瘤活性,从而促进黑素瘤的疾病进程,提示A20在肿瘤免疫中可能发挥着重要调控作用。然而,作为关键的免疫调控分子,肿瘤细胞内A20是否同样能够发挥针对免疫微环境的调控作用,进而影响肿瘤细胞的免疫治疗疗效仍属未知,其在肿瘤细胞内调控肿瘤免疫学行为的机制亦缺乏研究。基于此,我们提出以下科学假说:黑素瘤中A20表达水平较正常黑素细胞升高,一方面可以通过激活特定促癌信号促进黑素瘤进展;另一方面通过调控炎症相关信号促进黑素瘤PD-1/PD-L1免疫治疗抵抗。靶向抑制A20表达能同时阻止黑素瘤发展及肿瘤PD-1单抗治疗抵抗。目的:通过黑素瘤细胞分子生物学实验、动物模型研究及临床样本分析,阐明A20在黑素瘤进展与黑素瘤PD-1单抗治疗抵抗中的作用,并阐明其具体分子机制,为黑素瘤的治疗提供新的靶点和思路。研究方法:1.黑素瘤中A20表达水平的检测:通过q RT-PCR和western blot实验检测正常人黑素细胞（HPM）和多种黑素瘤细胞系中A20的m RNA和蛋白表达水平;通过免疫荧光实验分别检测表皮含黑素细胞的B6.Cg-Tg（KRT14-Kitl*）4XTG2Bjl/J小鼠尾部和C57B/L6小鼠B16荷瘤瘤团组织中黑素细胞和黑素瘤细胞A20的表达强度。2.A20在黑素瘤细胞生长中的作用:使用特异性sh RNA沉默黑素瘤细胞中A20的表达,通过CCK8和集落形成实验检测沉默A20前后黑素瘤细胞增殖水平和集落形成水平;裸鼠荷瘤实验观察沉默A20前后瘤团生长速率及重量;流式细胞术及western blot实验检测沉默A20前后细胞周期变化及周期相关蛋白表达水平变化。3.A20在黑素瘤转移中的调控作用:使用特异性sh RNA沉默黑素瘤细胞中A20的表达,通过Transwell实验观察沉默A20前后黑素瘤细胞侵袭和迁移能力的变化;通过细胞骨架蛋白荧光染色观察沉默A20前后细胞骨架蛋白排列变化;通过western blot实验检测细胞侵袭迁移相关蛋白表达水平差异;通过给予C57B/L6小鼠尾静脉注射B16F10细胞构建小鼠黑素瘤肺脏转移模型,观察小鼠沉默A20前后黑素瘤肺转移灶数量变化。4.A20调控黑素瘤生长和侵袭转移的具体分子机制:通过western blot实验检测沉默或者过表达A20后黑素瘤细胞Akt及其下游分子磷酸化水平变化;通过免疫组化实验检测沉默A20的黑素瘤瘤团组织中Akt磷酸化水平的变化;在黑素瘤细胞中过表达A20的同时联合使用Akt阻断剂,通过CCK8方法、克隆形成实验和Transwell实验观察细胞增殖和迁移能力变化。5.A20通过调控Akt信号影响黑素瘤糖酵解代谢:通过代谢物检测试剂盒检测联合使用过表达A20质粒和Akt抑制剂处理条件下黑素瘤细胞培养基中葡萄糖和乳酸的含量变化;通过ATP检测试剂盒检测上述处理条件下黑素瘤细胞内ATP含量的变化;同时检测上述处理条件下黑素瘤培养基的PH值变化。在此基础上,通过TCGA SKCM数据库分析揭示A20和糖酵解相关分子PKM2、PGAM1、PDK4、HK3、FBP1、ENO2表达间的相关性,通过q RT-PCR实验检测沉默A20后上述糖酵解关键基因的表达水平变化。6.A20表达与黑素瘤患者PD-1单抗治疗抵抗间的相关性:收集11例即将接受PD-1单抗治疗的黑素瘤患者的瘤团组织和外周血样本,使用western blot检测患者瘤团内A20的表达水平,使用组织切片H＆E染色观察A20高水平表达和A20低水平表达的瘤团中淋巴细胞浸润情况,使用免疫荧光实验观察A20高水平表达和A20低水平表达瘤团中CD8+T细胞的浸润情况,使用流式细胞术检测上述黑素瘤组织中瘤团浸润CD8+T细胞中Ki-67,Perforin和Granzyme B的表达水平,并分析其与瘤团组织中A20表达水平间的相关性。随后根据上述患者接受免疫治疗后的临床反应按照实体瘤标准化疗效评价标准（RECIST v1.1）进行判定后分为治疗反应组和治疗抵抗组,其中治疗反应组6例,治疗抵抗组5例,两组间性别和年龄因素匹配无显著差异。在此基础上,通过Kaplan-Meier生存分析明确黑素瘤组织A20表达水平与上述患者预后的相关性。7.在动物水平阐明A20对黑素瘤PD-1单抗治疗效果的影响:使用CRISPR/Cas9技术获得A20缺失的B16F10细胞系,通过在C57B/L6小鼠皮下注射的方式获得荷瘤模型。在此基础上,给予小鼠腹腔注射PD-1单抗治疗后,分别进行生存分析、瘤团切片H＆E染色及瘤团流式细胞术分析观察A20对PD-1单抗治疗后瘤团浸润淋巴细胞与CD8+T细胞功能的影响。8.在细胞水平明确黑素瘤细胞A20对CD8+T细胞的调控作用:将上述接受PD-1单抗治疗后的荷瘤小鼠外周血PBMC与野生型或A20缺失的B16F10细胞进行体外共培养,通过流式细胞术检测共培养黑素瘤细胞的凋亡水平和PBMC中CD8+T细胞的功能。9.在动物水平明确A20调控PD-1单抗治疗效果依赖于瘤团浸润CD8+T细胞:使用野生型或A20缺失的B16F10细胞进行小鼠荷瘤,在不同实验组分别进行PD-1抗体和（或）CD8抗体腹腔注射,观察小鼠瘤团生长速率和质量变化,并进行瘤团组织切片HE染色及瘤团细胞流式细胞术检测瘤团内浸润CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞比例变化。10.黑素瘤A20与PD-L1表达的相关性及调控机制探究:通过TCGA SKCM数据库、黑素瘤组织微阵列芯片（Tissue Microarray,TMA）、免疫组化染色和黑素瘤组织western blot实验分析A20和PD-L1表达水平之间的相关性。通过western blot实验、流式细胞术及荷瘤瘤团免疫组化方法明确A20对PD-L1总蛋白表达及膜表面表达的调控作用。11.在动物水平明确A20通过促进PD-L1表达介导PD-1单抗治疗抵抗的作用:通过在C57B/L6小鼠皮下注射B16F10细胞（转染过表达PD-L1质粒的野生型或A20缺失型B16F10细胞）的方式获得小鼠荷瘤模型,在此基础上给予小鼠PD-1单抗治疗,观察瘤团生长和重量的变化情况;同时通过流式细胞术分析瘤团浸润CD8+T的数量和PD-1+CD8+T的数量变化;进一步通过流式细胞术分析瘤团浸润CD8+T的Ki67和Granzyme B表达比例变化。12.在细胞水平明确黑素瘤细胞A20通过调控PD-L1表达对CD8+T细胞的调控作用:将上述接受PD-1单抗治疗后的荷瘤小鼠外周血PBMC与转染过表达PD-L1质粒的野生型或A20缺失型B16F10细胞进行体外共培养,通过流式细胞术检测共培养黑素瘤细胞的凋亡水平和PBMC中CD8+T细胞的功能变化。13.A20促进PD-L1表达升高的具体分子机制:通过对TCGA SKCM数据库进行KEGG通路分析,揭示A20与STAT3信号通路之间的关系;通过western blot、免疫荧光、流式细胞术和染色质免疫共沉淀实验明确A20通过激活STAT3信号促进PD-L1的表达。14.A20活化STAT3信号并促进PD-L1表达的具体分子机制:通过免疫共沉淀实验结合蛋白质谱分析发现A20泛素化修饰的底物分子PHB,并明确其与A20和STAT3之间的相互结合作用;通过构建点突变质粒、免疫印迹、免疫共沉淀和蛋白半衰期分析揭示A20泛素化修饰并降解PHB蛋白表达的作用和具体位点。15.在临床样本中分析A20-PHB-PD-L1轴的表达水平相关性及A20在预估黑素瘤PD-1单抗治疗反应中的作用:通过TCGA SKCM数据库分析PHB与A20和PD-L1m RNA间的表达相关性;分析A20高表达和低表达黑素瘤组织中PD-1+CD8+T细胞中Ki-67阳性率与患者肿瘤负荷比率;分析黑素瘤组织中A20蛋白表达量与患者外周血PBMC中CD8+PD-1+T细胞颗粒酶和穿孔素表达之间的相关性。主要研究结果:1.A20在黑素瘤中表达显著升高:与正常人黑素细胞相比,A20的m RNA及蛋白表达水平在多种不同黑素瘤细胞系中均明显升高;与C57B6.Cg-Tg（KRT14-Kitl*）4XTG2Bjl/J小鼠尾部的正常黑素细胞相比,C57B/L6小鼠B16细胞荷瘤组织中A20表达水平显著升高。2.A20可通过推动细胞周期进展、促进黑素瘤细胞的增殖和黑素瘤生长:沉默A20表达可显著抑制黑素瘤细胞增殖速率和集落形成数量;沉默A20表达可显著阻止黑素瘤瘤团生长,减少瘤团质量和体积;沉默A20表达可明显抑制促细胞周期相关蛋白Cyclin D和p-Rb（S780）的表达水平,阻碍细胞周期进程。3.A20高表达促进黑素瘤转移:沉默A20表达可显著抑制黑素瘤细胞侵袭和迁移能力;与对照组相比,沉默A20表达后黑素瘤细胞骨架蛋白排列紊乱、极性消失;沉默A20表达还可调控上皮-间质转化相关蛋白分子的表达水平;在黑素瘤小鼠肺转移模型中,沉默A20可明显减少黑素瘤肺转移灶形成。4.A20通过活化Akt信号促进黑素瘤进展:沉默A20表达可明显降低Akt磷酸化水平及其下游分子m TOR、4E-BP1和70S6K的磷酸化水平,过表达A20则明显促进上述蛋白的磷酸化;在裸鼠荷瘤中,沉默A20的荷瘤瘤团中Akt的磷酸化水平明显降低;Akt阻断剂可部分降低A20过表达后的黑素瘤细胞增强的增殖和迁移能力。5.A20通过活化Akt信号促进黑素瘤细胞糖酵解:过表达A20可升高黑素瘤细胞培养基中乳酸水平、降低葡萄糖含量,说明A20过表达可提升黑素瘤细胞糖酵解能力。Akt阻断剂可部分抑制A20过表达对糖酵解的促进作用。在此基础上检测黑素瘤细胞培养基的PH值发现,过表达A20可降低培养基PH值,而联合使用Akt阻断剂则可部分回复因过表达A20所降低的PH值。进一步检测细胞内ATP含量发现,过表达A20可提升细胞内ATP含量,而联合使用Akt阻断剂则部分抑制这一作用。TCGA SKCM数据库分析发现A20的m RNA水平和糖酵解关键基因PKM2、PGAM1、PDK4、HK3、FBP1、ENO2的表达水平均呈现显著正相关;q RT-PCR实验证明沉默A20可明显抑制黑素瘤细胞中上述分子的m RNA表达。6.黑素瘤组织A20表达升高与患者PD-1抗体治疗抵抗密切相关:与PD-1单抗治疗敏感组相比,治疗抵抗组黑素瘤患者瘤团A20表达水平显著升高;瘤团高水平表达A20的黑素瘤患者在接收PD-1单抗治疗后预后较差;黑素瘤瘤团高水平表达A20与瘤团浸润CD8+T细胞数量降低、CD8+T细胞Ki-67表达降低、以及穿孔素和颗粒酶的表达降低显著相关。7.A20表达水平升高介导黑素瘤PD-1单抗抵抗:在C57B/L6小鼠B16F10细胞荷瘤模型的基础上予PD-1单抗治疗,结果显示:黑素瘤中A20缺失可显著增加PD-1单抗治疗效果,抑制瘤团生长体积和重量,并显著延长荷瘤小鼠平均生存期;在PD-1单抗治疗后,黑素瘤中A20缺失可明显增加瘤团浸润淋巴细胞数量及CD8+T细胞中Ki67和颗粒酶B的表达;离体共培养体系流式细胞术分析证实,共培养体系中,敲除黑素瘤细胞内A20可显著促进细胞凋亡（单独敲除A20不会诱导黑素瘤细胞的凋亡）,同时显著增加共培养体系内CD8+T细胞的Ki67和颗粒酶B的阳性表达比例。8.黑素瘤中A20正向调控PD-L1的表达:TCGA SKCM数据库分析发现黑素瘤组织中A20的m RNA水平与PD-L1的m RNA水平呈现显著正相关;黑素瘤组织微阵列（TMA）免疫组化染色发现,A20的表达水平和PD-L1的表达水平显著正相关;western blot实验证实人黑素瘤组织中A20的蛋白表达水平和PD-L1的蛋白表达水平显著正相关。流式细胞术分析发现沉默A20表达可显著抑制PD-L1总蛋白表达及细胞膜表面PD-L1蛋白表达,敲除A20可显著抑制B16F10荷瘤瘤团中PD-L1表达。9.A20通过促进PD-L1表达介导PD-1单抗治疗抵抗:在PD-1单抗治疗时,黑素瘤中过表达PD-L1能够部分回复敲除A20导致的瘤团质量和体积降低,并抑制瘤团内浸润的CD8+T细胞和PD-1+CD8+T细胞数量,以及CD8+T细胞Ki67和颗粒酶B的表达。此外,过表达PD-L1能够降低共培养体系中A20缺失型黑素瘤细胞的凋亡水平,同时抑制共培养体系内CD8+T细胞Ki67的表达和颗粒酶B的分泌。10.A20通过促进STAT3磷酸化正向调控PD-L1表达水平:通过在TCGA SKCM数据库中分析明确A20表达与JAK-STAT信号通路间的高度相关性;沉默A20可显著抑制STAT3 Y705位点磷酸化及其下游靶基因Mcl-1和c-myc的表达水平。阻断STAT3活性可部分抑制过表达A20所导致的PD-L1的m RNA水平、蛋白水平和细胞膜表达水平升高。11.A20通过泛素化修饰作用降解PHB促进STAT3活化:通过免疫共沉淀联合蛋白质谱分析发现STAT3蛋白的抑制分子PHB为A20的下游靶分子;免疫共沉淀实验发现PHB、A20和STAT3三者之间存在相互结合;沉默PHB可通过促进STAT3磷酸化增强PD-L1的表达;使用蛋白酶体抑制剂MG132抑制蛋白酶体活性可减轻过表达A20对PHB表达的抑制作用,而沉默A20可延长PHB蛋白的半衰期,同时降低PHB蛋白的泛素化修饰;突变PHB蛋白K186和K202位点可显著削弱A20对PHB的泛素化修饰作用。12.A20-PHB-STAT3轴介导黑素瘤患者PD-1单抗治疗抵抗的数据库验证:TCGA SKCM数据库分析发现PHB的m RNA表达分别与A20和PD-L1的m RNA水平呈现显著负相关;人黑素瘤组织A20表达与患者PD-1单抗治疗反应明显负相关,与PD-1+CD8+T细胞Ki67阳性率和肿瘤负荷的比值明显正相关,且与PD-1+CD8+T细胞的颗粒酶B、穿孔素阳性率明显负相关。结论:通过本课题的研究,我们首次发现黑素瘤中A20的表达水平显著升高,并揭示其在黑素瘤生长和转移中的重要推动作用;进一步研究发现,A20可通过活化Akt信号及其相关的糖酵解途径促进黑素瘤细胞增殖和侵袭迁移能力。在此基础上,我们率先揭示黑素瘤组织A20表达升高与PD-1单抗治疗抵抗间的密切关系,并分别在体内和体外水平证实A20可通过促进PD-L1的表达介导PD-1单抗的治疗抵抗。同时,A20可通过泛素化修饰新底物分子PHB分子,促进STAT3的活化并进一步介导PD-L1的表达水平升高。我们的研究表明,A20有望成为可以预测黑素瘤患者PD-1单抗治疗抵抗的潜在分子标志物。更为重要的是,靶向A20同时具有抑制肿瘤发展与增加PD-1治疗敏感性的双重作用,为黑素瘤的免疫联合治疗提供了潜在靶点。