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微生物谷氨酰胺转胺酶（Microbial Transglutaminase,MTG,EC 2.3.2.13）是一种转移酶,其作用是催化相同或不同蛋白质之间的交联反应,形成高分子复合物。因其来源于微生物,便于工业化生产,在医药工业尤其是食品领域中应用广泛。但是目前的市售MTG热稳定性不佳,导致其在高温食品生产制作中的应用受限。为了获得热稳定性更好的MTG,本文以实验室保存的从土壤中筛选得到的八株产MTG菌株为实验对象,经生物信息学方法分析及酶活半衰期测量,从八株菌株中进一步筛选得到菌株MJ-7,其所产的MTG具有最优良的热稳定性,本文将其命名为MTG-MJ7。为了得到纯度高的MTG-MJ7以便进行后续酶学性质的分析,对菌株MJ-7的发酵条件及MTG-MJ7的纯化条件进行优化。通过对液体酶制剂配方及固定化酶的研究,进一步提高了MTG-MJ7的热稳定性,并将其应用在高温喷雾干燥及食品领域当中。本文的主要结论如下:1、本文以实验室保存的八株产MTG菌株为实验对象,对其进行全基因组测序,将八株菌编码MTG的基因序列翻译后的氨基酸序列与市售MTG的氨基酸序列进行比对,挑选出三株候选菌株MJ-5、MJ-6、MJ-7,此三株菌所产MTG的理论氨基酸序列与市售MTG的氨基酸序列存在差异,将其所产MTG分别命名为MTG-MJ5、MTG-MJ6、MTG-MJ7。使用生物信息学方法对这三种MTG及市售MTG的结构进行分析,并通过酶活半衰期检测证明MTG-MJ7的热稳定性优于市售MTG。综合上述分析及实验得出结论,最能影响酶蛋白热稳定性的因素是结构中α螺旋的含量及氢键的数目,且热稳定性与α螺旋含量及氢键数目成正比。对菌株MJ-5、MJ-6、MJ-7编码MTG的相关片段进行PCR扩增,并对PCR产物进行测序,验证翻译后的理论氨基酸序列的真实性;2、为了初步获得一条工业化生产的工艺,使菌株MJ-7能够应用于后续生产,对菌株MJ-7的发酵条件及MTG-MJ7的工业纯化方法进行初步研究。通过优化碳氮源,确定了其最佳碳氮源分别是甘油和酵母浸粉FM802,在最优条件下MJ-7菌株发酵最高酶活达到0.91 U/m L,较未优化前的0.50 U/m L提高了82%。然后进行实验室规模的发酵罐小试放大培养,并对温度和p H进行优化。最终确定发酵罐小试最佳条件为25℃、p H 6.5,此条件下酶活达到0.95 U/m L,较未优化前（发酵罐30℃、p H 7.4）的0.86 U/m L提高了10.5%。经过超滤浓缩、乙醇沉淀,酶活由0.95 U/m L提高至16.97 U/m L,酶活回收率为71.45%,比酶活由0.16 U/mg提高至0.59 U/mg,纯化倍数为3.69,初步证实了其工业纯化的可行性;3、为了便于进行后续的酶学性质及应用研究,探讨杂质对MTG-MJ7热稳定性的影响,本文对MTG-MJ7的精细纯化方式展开研究,在工业纯化方法的基础上进一步提高它的纯度。在精细纯化中,确定了阴离子交换层析的方法,优化条件为p H 8.0、10 mmol/L的磷酸盐缓冲液,上样量10 mg。此条件适用于体系的放大,酶活回收率可达76.25%,比酶活由0.59 U/mg提高至4.33 U/mg,纯化倍数为7.34。最后结合凝胶层析,MTG-MJ7达到98.7%电泳纯。纯化后的MTG-MJ7在80℃下的酶活半衰期较纯化前延长了50%,表明杂质的减少有助于热稳定性的提升;4、对纯化后的MTG-MJ7进行酶学性质的分析,首先经高分辨质谱检测其分子量为37836.39 Da,与理论序列分子量一致,证明其理论序列即为实际序列。通过底物特异性实验找到其最适底物为底物5。MTG-MJ7的最适反应温度介于54℃～56℃之间,高于市售MTG,且中高温下的酶活半衰期也长于市售MTG,验证其热稳定性优良的特性。MTG-MJ7的最适p H与p H稳定性和市售MTG一致;5、纯化后MTG-MJ7的热稳定性有一定程度的改善,但仍不是特别理想。为进一步提高MTG-MJ7的热稳定性,本文从液体酶制剂配方及固定化酶两方面进行研究。液体酶制剂配方方面,首创了?KTA-96孔板高效筛选法,筛选出甘油和海藻糖的适宜浓度范围。并通过正交实验、抑菌实验及金属离子实验,确定最优配方为35%甘油+21%海藻糖+0.003%H2O2+100 mmol/L氯化钾,此配方可使MTG-MJ7的热稳定性提高,80℃下酶活半衰期较纯酶延长33.3%。将此最优配方下的MTG-MJ7进行海藻酸钠凝胶固定化,最佳固定化条件为2%海藻酸钠、2%氯化钙、30 min凝胶时间,固定后可使80℃下的酶活半衰期较纯酶延长116.7%;6、将配方优化后的MTG-MJ7酶制剂应用于高温喷雾干燥及食品中。经120℃高温喷雾干燥后的MTG-MJ7固体酶制剂,酶活回收率为86.2%,满足工业化生产的需求。在食品制作方面,在60℃下,较之市售MTG,MTG-MJ7能更加显著地提高明胶产品、蛋清产品的凝胶强度。并证实了一步法制作肉丸的可行性,经一步法制作的鸡肉丸,硬度达到408.5±24.2 g,弹性达到47.4±2.6%,与传统两步法的结果（硬度424.2±32.9 g,弹性49.2±2.7%）无显著性差异。电镜照片显示,一步法制作的肉丸切面光滑均一,无明显孔洞,与两步法的结果一致。综上所述,本文从发酵、纯化、酶学性质鉴定及生产应用方面对MTG-MJ7的性质进行了研究,并对其热稳定性进行了分析和人工改良,为实现其商品化奠定理论基础。