研究背景帕金森病(PakinsonsDisease，PD)是常见的老年神经变性疾病，临床上以静止性震颤，强直，动作减少，姿势和平衡障碍为主要特点。病理上以黑质致密部多巴胺能神经元丢失和存活的神经元内形成特异的包涵体结构lewy体以及纹状体多巴胺含量降低为特点。其发病机制不明，目前认为遗传因素和环境因素对该病均起一定的作用。 遗传方面的研究迄今已发现8个与PD相关的基因，而其中a-synuclein，Parkin，UCHL-1的缺陷或突变都能够造成泛素蛋白酶体系统降解异常蛋白的功能障碍。环境方面，许多环境毒素如农药、杀虫剂等也与PD的发病密切相关。1-甲基4-苯基-1，2，3，6四氢吡啶(MPTP)，6-羟基多巴胺(6-OHDA)，鱼藤酮(rotenone)等毒素造成的能量代谢障碍以及氧化应激所产生的异常蛋白也需要经过泛素蛋白酶体系统降解，于是泛素蛋白酶体系统功能障碍似乎是遗传因素和环境因素的共同作用环节，因而泛素蛋白酶体系统功能障碍在PD发病机制中的作用受到广泛重视。 许多实验也都证明了泛素蛋白酶体系统功能障碍在PD发病机制中的作用。无论是细胞培养还是动物实验，应用蛋白酶体抑制剂后都造成了神经细胞的变性死亡并且伴有包涵体的形成，而且在动物实验中多巴胺能神经元尤其易感。然而也有不同的研究结果，有研究表明应用蛋白酶体抑制剂可以阻断某些毒素对神经元的毒性，从而对神经元起到保护作用。众所周知，由于PD病因和发病机制还不清楚，目前尚无彻底治愈PD的治疗方法，最有效的药物左旋多巴也仅限于症状的控制，并不能阻止疾病的进展，而且长期应用会产生严重的副作用。研究该病的病因和发病机制是彻底攻克该病的根本途径。泛素蛋白酶体系统功能障碍有可能是遗传因素和环境因素的共同作用环节，在PD发病机制中具有重要作用。因而深入研究泛素蛋白酶体系统的功能及其在PD发病机制中的作用具有重要的意义。 研究目的 1.探索蛋白酶体抑制剂对PD细胞模型是否具有保护作用，并且初步研究其保护机制。 2.验证以往有关蛋白酶体抑制剂相互矛盾的实验结果是否由于浓度的不同。 3.研究蛋白酶体抑制剂药理作用与蛋白酶体活性之间的关系。 研究方法以SH-SY5Y细胞为研究对象，以50uM的6-OHDA处理的SH-SY5Y细胞作为细胞受损伤的模型，在此基础上加用蛋白酶体抑制剂lactacystin，以磺酰罗丹明B(SulforhodamineB，SRB)法、细胞计数法以及直接镜下观察细胞密度和形态的方法检测细胞活力，来证明蛋白酶体抑制剂对细胞可能的保护作用。在此基础上再加用MEK1/2的特异抑制剂PD98059验证其保护作用是否通过MAPK途径，以初步研究其保护机制。在上述实验的基础上，扩大蛋白酶体抑制剂的浓度范围，证明蛋白酶体抑制剂在高浓度和低浓度时对细胞的作用，验证以往有关蛋白酶体抑制剂相互矛盾的实验结果是否由于浓度的不同。在上述实验的基础上，用蛋白酶体活性检测试剂盒检测各组的蛋白酶体活性，研究蛋白酶体抑制剂药理作用与蛋白酶体活性之间的关系。 结果蛋白酶体抑制剂在0.1～0.5uM之间的较低浓度时，对6-OHDA诱导的神经细胞毒性有阻断作用，对神经细胞有保护作用。其保护作用可以被MEK1/2的特异抑制剂PD98059阻断。说明其保护机制与MAPK途径有关。 在0.01～0.5uM的低浓度时单用蛋白酶体抑制剂对细胞存活率无明显影响，而在2～5uM的高浓度时单用蛋白酶体抑制剂就可以降低细胞存活率，与6-OHDA合用可以使存活率进一步降低，说明蛋白酶体抑制剂能加重6-OHDA的毒性，或者说两者有协同的毒性。可见在有毒素损伤的情况下，低浓度的蛋白酶体抑制剂对细胞有保护作用，高浓度的蛋白酶体抑制剂对细胞有毒性作用。 对蛋白酶活性的研究表明：在有保护作用的低浓度时，蛋白酶体活性受到轻度抑制，仍然在60％以上，在有毒性的高浓度时，蛋白酶体活性受到严重抑制，活性下降到30％以下。 结论蛋白酶体抑制剂在较低浓度时，对6-OHDA诱导的神经细胞毒性有阻断作用，对神经细胞有保护作用。其保护机制与MAPK途径有关。蛋白酶体抑制剂在较高浓度时，加重6-OHDA诱导的神经细胞毒性，促进细胞的变性坏死。蛋白酶体抑制剂的药理作用与其浓度有关，呈浓度依赖性。蛋白酶体抑制剂对细胞的作用与蛋白酶体活性受抑制的程度有关：蛋白酶体活性轻度抑制时，对细胞有保护作用，蛋白酶体活性严重抑制时，对细胞有毒性。