小麦的耐逆性是由多基因控制的复杂形状,耐逆性的提高需要胁迫应答、离子转运、次生代谢以及能量代谢等多方面因素。目前分子生物学研究及应用已经显著提高了水稻、玉米等对不良环境的抵抗性,但在小麦中,这种进展相对比较缓慢。因此有必要加强加深对小麦逆境下分子机理的研究,而现阶段主要的方式是从转录组变化中找出候选基因,进而验证基因在抗逆中的功能,已经有一些成功的报道。但对于普通小麦这样一个异源六倍体来讲,对其耐逆基因的报道很少,对其整个耐逆响应网络还缺乏研究。小麦渐渗系山融3号(SR3),是普通小麦济南177(Triticum aestivum L.2n=42)同耐盐小麦近缘属长穗偃麦草(Ae)(Thinopyrum ponticum 2n=70)不对称体细胞融合后代。SR3耐逆性高于JN177,特别是在盐/旱胁迫下。SR3同JN177的对比研究,提供了一个很好的研究小麦耐逆机制的平台。早期的研究表明,SR3基因组中渐渗了Ae的基因组序列,其抗逆性是由一个主效基因位点和多个微效基因控制。但具体到哪些基因在起作用,还不是很清楚。在实验室前期对SR3重要耐逆相关基因TaCHP和TaCEO的功能研究中,发现它们在过表达拟南芥中增加抗逆性的同时,都影响AtMYB15的表达。而在拟南芥中,MYB家族是最大的一个转录因子家族；其中一些MYB基因可以显著提高拟南芥抗逆性。类似的在水稻和玉米中,一些MYB基因参与到抗逆响应中。而对小麦MYB家族在抗逆性中作用的研究还没有报道。本论文通过分析SR3芯片数据,整理出了38个响应胁迫的MYB基因(Unigene/EST)。通过RT-PCR分析,系统研究了小麦渐渗系MYB基因对盐/旱胁迫的响应,揭示MYB基因参与耐逆调控的可能方式,并分析了MYB基因发育周期中的表达模式；对JN177/SR3间MYB基因等位变异进行了分析,进一步阐明MYB参与胁迫的方式及内容；选择了其中一个在JN177与SR3的具有序列差异的Tamyb31基因,进行功能鉴定。主要的研究内容及结果包括：1.MYB基因信息的整理在实验室芯片数据中,通过探针序列的BlastN分析,得到了SR3和JN177三叶期表达的36个MYB基因对应的Unigene(EST)信息。由于MYB家族在水稻和拟南芥中较为庞大,分析的这36个MYB基因只是小麦MYB基因家族的一部分。为此,又进一步从山融3号cDNA文库中克隆到了另外两个MYB基因,加起来总共有38个基因。2.MYB基因对盐/旱胁迫的响应分析及发育周期表达模式分析通过RT-PCR方法研究了SR3及JN177在盐/旱胁迫下不同时间点的差异,验证了芯片结果。同时发现在6个时间点间,35个MYB基因响应盐/旱胁迫一共存在42种表达模式(另外3个MYB低于RT-PCR的检测限)。不同MYB基因在同样的处理下,有着不同的响应模式,例如盐处理SR3叶中MYB3/17呈L1型表达模式,快速响应盐胁迫处理,在0.5h达到峰值,之后持续降低表达量；而MYB 1/8/9/11/15/16/19/27/31/33则呈L6型表达模式,即呈现波浪形表达模式,在0.5/6h到峰值。这表明在同样的器官同样的品种同样的处理下,各个MYB之间对胁迫信号的响应不同,这可能与MYB基因的功能差异有关。同一MYB基因在不同胁迫下的响应模式不一致,例如SR3叶中,MYB31在盐/旱胁迫下表达模式分别为L6/L41型。L6型呈现波浪形变化；L41型呈现一种逐步下降的情况,在0.5h升至最高,之后表达逐渐下降,在12h略有回升,之后接着下降。这表明MYB31在盐/旱胁迫信号转导中的位置不同,也就是体现了盐/旱胁迫信号转导的差异。同一MYB基因在不同的器官中表达模式不一致,例如盐处理下SR3中的MYB4,在叶/根中分别呈L11/L16型表达模式,L11型在3h有个表达高峰,而在其余时间点表达量变化不明显；L16型则是从开始处理后就呈现下降趋势。这体现了盐胁迫下,根和叶的同一MYB基因对胁迫的响应不同。同一MYB基因在SR3和JN177中间的表达模式也不一致,在盐处理下的根中,MYB3分别呈L15/L7型表达模式。L15型是Oh之后表达量就开始下降,L7型则是呈波浪型变化。这种差异体现了不同品种对胁迫响应的差异,可能是造成对胁迫抗性差异的原因。也有少数几个MYB基因在特定情况下存在一致的表达模式,例如盐处理下的叶中,SR3和JN177中的MYB29都呈L7型表达模式；盐处理下济南177中的MYB15,在根和叶中都呈现出L6型表达模式；JN177根中的MYB13在盐旱胁迫下表达模式都呈现出L7型。整体上看,MYB基因对胁迫的响应比较复杂。如何去判断哪些MYB基因及其表达模式同SR3/JN177抗逆性差异相关。我们从两方面入手：第一方面,找出SR3/JN177各自特异的表达模式。在42种表达模式中,SR3/JN177间差异的表达模式有13种。SR3中特异的响应模式有L3/L1 1/12/13/20/23/37/38型,而JN177中特异的有L28/29/30/34/35/36型。这些差异对我们选择候选基因提供了线索；第二个方面我们选择单个目标基因进行功能研究,例如,我们鉴定了MYB31对应基因的功能,而其胁迫响应的模式有L6/L7/L17/L18/L26/L41型,这些类型对应的基因是我们进一步研究的基础。由于芯片取材选择了小麦的三叶期；为避免发育时期的限制,进一步比较了SR3不同发育时期MYB基因的表达谱。以上发现有助于提供候选MYB基因用于功能验证,并在育种中加以应用。3.MYB基因结构分析由于小麦含有A,B,D三个基因组,而SR3又是体细胞杂种后代,每个MYB基因在SR3中的拷贝数不清楚；参与胁迫响应的MYB,是不是其RT-PCR产物就仅对应一个转录本?而转录本的差异也会对SR3和济南177抗逆性差异产生影响,特别是当RT结果显示为同一表达模式时。为此我们将RT-PCR产物进行测序,同时又对对应的基因组序列进行了比较。在分析的15个MYB基因中,RT产物中仅有MYB5/22是一个转录本；而其余13个MYB基因,则有多余一个的转录本。这些转录本在JN177和SR3中普遍存在差异,可能是JN177和SR3抗逆性差异的原因之一。具体细化分析时,用等位变异来描述这些差异；我们发现这些差异主要是SNP差异,多数是Substitution, Indel位点仅存在两处。在同一个MYB基因中,不同等位基因位点发生的变化不同,例如在MYB5的两个等位位点,两个位点都存在G/A的SNP多态性,但存在的位置不同。不同的MYB基因,等位变化也往往不同,例如MYB19中,三个等位基因位点都发生了变化；而对MYB18来讲,两个等位基因位点上都没有发生序列上的变化。内含子中SNP-Indel的频率要高于外显子中的频率,而SNP-Substitution的频率在内含子中要低于外显子中的频率。在MYB9/22中,启动子的核苷酸多态性要大于基因编码区域的核苷酸多态性。SNP中的核苷酸转化方式以转换为主。通过分析,同时发现等位基因上的SNP可以使编码的氨基酸发生变化。我们认为在小麦抗逆研究中,除了要关注MYB基因表达模式变化,还要关注同样表达模式下哪些MYB转录本在其中起作用。4. Tamyb31功能研究在以上小麦MYB基因家族中,SR3的MYB31随胁迫上调表达,并且上调比较明显。从cDNA文库中分离得到了其全长,通过同源比对,SR3与JN177中的MYB31存在SNP-Substitution,并且导致其蛋白质氨基酸的变异,将其命名为Tamyb31。Tamyb31 cDNA由192bp的5’UTR,765bp的开放阅读框(ORF)以及298bp的3’UTR构成。通过体外DNA结合试验以及转录活性试验,证实了Tamyb31是起作用的转录本。通过设计特异的引物研究其胁迫响应模式,在山融3号的根中,其表达模式类似MYB31的情况,但在叶中不同于MYB31的表达模式。在盐旱处理下,Tamyb31都是在0.5h就明显上调表达,这表明Tamyb31参与早期盐旱胁迫信号的转导。在激素处理下,Tamyb31在0.5h瞬时上调表达,表明Tamyb31参与多种激素信号的转导。从发育时期来讲,Tamyb31在整个发育期中都有表达,而在拔节期中的茎中表达量最高。Tamyb31编码一个R2R3型MYB蛋白；同其它物种中的MYB蛋白相比,其SANT domain的保守性很高；亚细胞定位于细胞核内；结合Ⅰ/Ⅱ/ⅡG型MYB结合基序。Tamyb31的拟南芥过表达系明显增加了对盐/旱胁迫的抗性。在NaCl处理下,过表达系的根长明显长于对照的根长；同时过表达系增加了对LiCl/KCl的抗性。这表明Tamyb31可能增加对离子胁迫的抗性。在甘露醇处理下,过表达系同对照系的表型没有明显差异。在控水干旱处理时,过表达系存活率要高于对照系；这可能同过表达系较低的失水率有关。Tamyb31也增加了过表达系萌发时对NaCl和ABA的抗性。NaCl处理下,过表达系中AtP5CS1/CBF3基因的表达量高于对照；不处理情况下,AtABF3的表达量在过表达系中较高。Tamyb31可能通过调控这些基因的变化来提高拟南芥的抗性。同时我们又分析了AtCBF3/ABF3的启动子区域,发现两者启动子上有多个MYB结合位点,体外实验也证实Tamyb31可以结合这些启动子区域。Tamyb31与AtMYB15有很高的同源性,但两者在功能上有所差异。例如AtMYB15可以同AtICE1相互作用,而Tamyb31则不可；Tamyb31没有选择性的结合Ⅰ/Ⅱ/ⅡG型结合基序,而AtMYB15则优先结合Ⅱ/ⅡG基序。这表明两者之间在胁迫中的作用有所差异。通过对Tamyb31的研究,我们认为本文的研究方法是有效的,即能分离到在胁迫中起作用的MYB基因。鉴于水稻/拟南芥中多个MYB基因参与胁迫抗性的提高,小麦MYB抗逆相关基因的挖掘仍需继续。