储存红细胞(red blood cells,RBCs)输注能诱导创伤后炎症、增强感染、引发脓毒血症、导致感染性并发症,是导致患者死亡的独立危险因素,但其具体机制尚不明确。因此,要解决储存RBCs输注诱导创伤后炎症及增强感染这一临床问题,必须加强对其致病机制的研究。机体各重要器官,尤其是肝脏,在细菌感染的发生发展过程中具有重要作用。同时,肝脏在衰老RBCs的清除中也发挥着重要的作用,是快速清除RBCs和铁循环的主要器官。根据肝脏在细菌感染及RBCs清除中的调节活性及“储存红细胞诱导创伤后炎症并增强感染”的理论,我们推测:储存RBCs输注增强细菌感染,可能与储存RBCs输注加重细菌感染引发的肝损伤密切相关。为对上述推测进行验证,本研究将基于可视化监测技术监测储存RBCs促进细菌感染并引发肝损伤的作用过程,并对其机制进行探索。虽然Kupffer细胞与细菌感染诱导的肝损伤密切相关,而且储存RBCs输注与巨噬细胞之间关系也已经被证实,但储存RBCs输注对细菌感染后肝脏Kupffer细胞的影响,以及其对肝细胞内信号传导通路的影响至今未见相关报道,特别是在细菌感染期间输注储存RBCs后对肝脏Kupffer细胞极化和活化的调控机制仍不清楚。因此,本研究将探讨储存RBCs输注加重细菌感染并促进肝损伤是否与Kupffer细胞介导的免疫应答有关,并分析其引发肝损伤的分子机制,旨在了解储存RBCs对肝脏损伤的调控及其对细菌感染的影响,为创伤患者安全输血提供科学依据,对提高临床输血安全性和有效性具有重要意义。本研究分以下三个部分展开:1.储存RBCs输注在体内增强铜绿假单胞菌诱导的肝损伤首先,通过发光细菌的体外成像,证实细菌的荧光素酶活性与细菌CFU的数目成正相关。通过尾静脉注射铜绿假单胞菌(典型的革兰氏阴性细菌)诱导菌血症建立小鼠模型,利用活体成像分析小鼠体内的细菌感染情况。细菌的生物发光读数与通过常规计数确定的细菌CFU数呈正相关,证明生物发光可以应用于监测细菌增殖的变化。为了研究储存的RBCs输注对铜绿假单胞菌诱导细菌感染的影响,在菌血症小鼠模型中观察新鲜和储存RBCs输注后的效应,结果表明,输入储存的RBCs可以加剧铜绿假单胞菌感染并降低小鼠的存活率。同时根据细菌体内成像的信号显示,感染的最初4h内肝脏区域荧光信号最强,说明经静脉感染的铜绿假单胞菌早期主要聚集在小鼠肝脏。储存RBCs输注进一步导致细菌感染小鼠血清ALT和AST的水平升高,与肝切片的组织学检查结果一致。上述实验结果表明,储存RBCs的输注促进体内细菌增殖,增强铜绿假单胞菌诱导的肝损伤,加剧细菌感染的严重程度。2.储存RBCs输注增强细菌感染引发的肝损伤与Kupffer细胞的极化相关为了确定输注储存RBCs的促炎作用,在铜绿假单胞菌感染的小鼠中监测促炎细胞因子IL-6,IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。当铜绿假单胞菌感染的小鼠输注储存的RBCs时,感染后2h血清TNF-α、IL-6和IL-1β的水平显著高于输入新鲜RBCs的小鼠。上述实验结果表明储存RBCs输注可以增强细菌感染的全身炎症反应。为进一步探讨这些炎症细胞因子的产生是否与巨噬细胞相关,将离体骨髓来源的巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage,BMDM)与储存RBCs或新鲜RBCs孵育后,再加LPS刺激,结果显示储存RBCs组的上清液中IL-6和TNF-α水平显著高于新鲜RBCs组,表明与储存RBCs的孵育显著增强巨噬细胞的活化。通过流式细胞术测定F4/80+巨噬细胞亚型标记物,结果表明:与用新鲜RBCs处理的巨噬细胞相比,用储存RBCs处理的巨噬细胞M1特异性标记表达水平更高,而表达的M2特异性标记则没有显著差异。上述体外结果提示:M1-极化的巨噬细胞在由储存RBCs输注增强细菌感染引发的肝损伤中可能发挥重要作用。为了确定输入储存的RBCs对小鼠肝脏中Kupffer细胞的影响,对输注储存RBCs后小鼠肝脏中的Kupffer细胞表型标记物进行检测。PCR实验结果表明,储存RBCs的输注导致铜绿假单胞菌感染小鼠肝脏中的Kupffer细胞表型出现明显变化。与新鲜RBCs组相比,来自储存RBCs组的组织样品iNOS、TNF-α和MCP1 mRNA水平升高,显示储存RBCs的体内输注可以促进在肝脏的Kupffer细胞朝向M1表型的极化。体内实验结果也证实了M1-极化的巨噬细胞的确参与储存RBCs输注增强细菌感染引发的肝损伤过程。3.储存的RBCs通过干扰细菌感染小鼠肝细胞内NF-κB和JNK信号通路间的动态平衡诱导肝细胞凋亡为进一步探讨储存RBCs输注增强细菌感染引发肝损伤的作用机制,本部分结合实验室前期建立的肝脏NF-κB(nuclear factor-kappa B,核因子κB)、caspase-3可视化小鼠模型,研究储存RBCs输注对细菌感染小鼠肝细胞内NF-κB和JNK(c-Jun N-terminal kinase,c-Jun氨基末端激酶)信号通路间的影响。NF-κB激活对维持肝细胞存活起重要作用,通过水动力转染技术将pattB-NF-κB-Fluc报告基因整合到小鼠肝细胞中,可以通过生物荧光成像(BLI)监测NF-κB的动态活化。实验数据表明,细菌感染上调小鼠肝脏NF-κB的激活,而储存RBCs的输注抑制了细菌感染引起的NF-κB活化。这一结果也由EMSA(Electrophoretic mobility-shift assay,电泳迁移位移试验)实验进一步证实。同样通过水动力转染技术建立带有Caspase-3报告基因attB-ANLuc(DEVD)BCLuc的小鼠整合模型,通过BLI评估caspase-3活性。实验结果表明储存RBCs输注进一步增强了细菌感染引起的肝细胞JNK和caspase-3信号通路的活化。Western Blot结果显示,与来自储存RBCs组的肝脏样品相比,来自新鲜RBCs组肝样品中的p65蛋白磷酸化水平显著降低。以上结果表明,NF-κB信号通路在储存RBCs输入的铜绿假单胞菌感染小鼠中被抑制,而JNK介导的肝细胞凋亡途径被增强。因此,储存的RBCs可能通过干扰NF-κB存活途径和JNK死亡途径之间的动态平衡,进一步诱导肝损伤。总之,我们的研究结果显示储存RBCs的输注增强体内细菌感染诱导的肝损伤,加剧细菌感染的严重程度,降低铜绿假单胞菌感染小鼠的存活率。储存的RBCs输注增强促炎细胞因子如IL-6、IL-1β和TNF-α的产生,这些细胞因子在铜绿假单胞菌感染引发小鼠细菌感染相关的肝损伤中起重要作用。进一步研究表明,储存RBCs促进肝损伤与M1型Kupffer细胞极化相关。M1型Kupffer细胞及其分泌的促炎细胞因子通过增强JNK活化和抑制NF-κB活化来发挥其对肝细胞的作用,提示输注储存的RBCs破坏了肝脏中细胞存活和细胞死亡之间的平衡。这一作用机制的阐明对临床安全输血具有一定的指导意义。