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研究背景和目的埃博拉病毒是一种人畜共患烈性传染病病毒,属丝状病毒科病毒,致病性强,病死率高。世界卫生组织将其列为最危险的八种传染病病原体之一。埃博拉病毒目前发现共有5种基因型,其中扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire ebolavirus,ZEBOV)流行传播最广,危害最大。1976年,扎伊尔型埃博拉病毒在埃博拉河流域首次发现该病毒感染,其传染性极强,病死率高达50%～80%。2014～2015年,西非暴发ZEBOV疫情,夺走了 1.1万余人的生命。埃博拉病毒可透过与患者体液直接接触,或与患者皮肤、黏膜等接触而传染。病毒潜伏期可达2至21天,但通常只有5至10天。目前针对该病毒并无有效的治疗方法和应用疫苗,及早隔离防控是阻止疫情蔓延的唯一手段。上转发光检测技术(Up-converting Phosphor Technology,UPT)通过抗原抗体分子上标记上转发光纳米颗粒(Up-Converting Phosphor,UCP),具有无背景、无淬灭等优势,可提升传统免疫层析技术的敏感性、特异性、稳定性及定量检测能力。本研究以NP蛋白的线性表位片段为抗原,人工合成扎伊尔型埃博拉病毒NP蛋白编码基因片段1234～1815 bp,构建重组NP蛋白(Recombinant Nucleoprotein,rNP)重组工程菌,表达蛋白rNP;纯化rNP蛋白作为抗原,制备特异单克隆抗体,并进行效价评价;采用双抗体夹心免疫层析方法,制备扎伊尔型埃博拉病毒快速检测试纸条;以登革I型病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒和表达菌株BL21/DE3检验其特异性;以梯度稀释的rNP蛋白阳性标准品评价其敏感性,并建立定量标准曲线。建立了扎伊尔型埃博拉病毒的上转发光免疫层析快速检测技术,满足各级疾病预防控制、口岸传染病监控和生物安全防护等需求。研究方法1.扎伊尔型埃博拉病毒结构蛋白的生物信息学分析通过查阅文献及利用Protean、Clustal_X、blastn等生物信息学软件,分析Genebank数据库收集的2014-2015年ZEBOV基因及氨基酸残基序列,确定各结构蛋白的抗原表位位置、同源性,寻找到合适的抗原片段,并优化开放阅读框密码子。2.扎伊尔型埃博拉病毒重组蛋白的制备与纯化人工合成扎伊尔型埃博拉病毒抗原靶标编码基因片段,重组到pET-28(a)表达载体中,然后将表达重组质粒转化BL21/DE3工程菌中,构建rNP重组工程菌。诱导原核表达并通过His-tag与液相色谱纯化rNP蛋白作为抗原。3.抗rNP重组蛋白单克隆抗体的制备与评价选取7周龄、雌性Balb/c小鼠。取纯化的rNP蛋白为抗原,小鼠腹股沟多点注射免疫Balb/c小鼠,每14d加强免疫一次。重复5次后,取免疫小鼠脾细胞,经细胞融合和阳性杂交瘤细胞筛选、克隆,获得稳定传代细胞株。杂交瘤细胞扩大培养,小鼠腹腔注射。10d后,取腹水,液相色谱纯化抗体,SDS-PAGE凝胶电泳观察纯度,并用间接ELISA法测定其各抗体株效价,选取效价最佳两株进行下一步实验。4.上转发光免疫层析检测试纸条的组装与优化以上一步筛选到的两株抗rNP单克隆抗体为材料,通过效价和预实验分析,确定两株抗体的分配,其中一株作为标记抗体标记上转发光材料(UCP),另一株作为捕获抗体固定在硝酸纤维素薄膜上,分别确定抗体的合适工作浓度和标记方式。采用双抗体夹心免疫层析模型,以固定捕获抗体的硝酸纤维素膜为分析膜,以吸收容纳上转发光材料标记单抗的玻璃纤维素膜为结合垫,以未处理的玻璃纤维素薄膜为样品垫。将上述试纸条关键部件组装在黏性底衬上形成免疫层析试纸条。通过优化样品稀释液、抗体标记工艺,形成初步稳定、良好的检测试纸条。5.试纸条敏感性、特异性及定量检测性能评价以登革I型病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒和表达菌株BL21/DE3的蛋白质样品检验其特异性,以梯度稀释的rNP蛋白阳性标准品评价其敏感性,并建立定量标准曲线验证试纸条的性能。结果1.扎伊尔型埃博拉病毒结构蛋白的生物信息学分析采用生物信息学分析方法,筛选出扎伊尔型埃博拉病毒核衣壳蛋白特异片段(NP412～605aa)。通过文献及Clustal_X、blastn分析,其氨基酸残基序列与同属马尔堡病毒、其他基因型埃博拉病毒氨基酸残基序列相比,具有极低的序列同源性,其预期的抗原特异性极强;通过Protean软件分析,该片段高度集中了 NP蛋白抗原表位,二级结构为β折叠,是理想的抗原线性表位特异靶标。2.扎伊尔型埃博拉病毒重组蛋白的制备与纯化人工合成扎伊尔型埃博拉病毒NP蛋白编码基因片段1234～1815 bp,长度为582bp,并成功构建rNP蛋白重组工程菌。IPTG诱导重组工程菌原核表达出氨基酸残基长度为194aa,纯化后表征大小约为48 KDa,与预计23.2 KDa位置出现异常偏移。根据测序、开放阅读框密码子分析和His-tag抗性分析,rNP已按预设步骤正常表达,但该抗原片段存在高度酸性区域,将会使其表征大小出现异常偏移。3.抗rNP重组蛋白单克隆抗体的制备与评价制备出抗rNP蛋白单克隆抗体共计25株,间接ELISA法检验效价后,经筛选纯化,得到2株效价高的单克隆抗体mAb-rNP-1和mAb-rNP-2,测定抗体样品蛋白含量为5 mg/mL,两株抗体的效价点均为10ng/mL,两株抗体效价满足用于双抗体夹心的免疫层析实验要求。4.上转发光免疫层析检测试纸条的组装与优化实验确定了双抗体夹心模型的组成方案,mAb-rNP-1为标记抗体,按每50μg mAb-rNP-2与500μg UCP比例,共价偶联,形成UCP标记单抗结合物。mAb-rNP-2为捕获抗体,以2mg/mL的浓度固定在硝酸纤维素膜上。通过初步分析,在免疫层析过程中能成功形成抗体-抗原-抗体-标记物复合结构。通过优化样品稀释液的成分比例和极限测试,成功降低了试纸条的工作背景;优化了单抗mAb-rNP-1标记工艺程序步骤,成功将试纸条的灵敏性和工作背景平衡到适合检测的工作条件;确定了阴阳性判定的cutoff值,完成了上转发光免疫层析快速检测试纸条(ZEBOV-UPTLF)的制备。5.试纸条敏感性、特异性及定量检测性能评价以登革Ⅰ型病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒、流行性乙型脑炎病毒和表达菌株BL21/DE3的蛋白质样品检验其特异性,结果显示rNP蛋白样品、rNP重组工程菌全蛋白样品为阳性,DV1、CHIKV、ZIKV、JEV均阴性,无交叉反应。敏感性的梯度实验中,rNP蛋白浓度的检出下限为0.1 ng/μL,重复测量的变异系数在7.6%;检测方法在rNP蛋白浓度为100～0.1ng/μL之间具有很好的线性关系,相关系数r为0.98776,可满足ZEBOV的定量检测;检测用时15min,适合大批量样品快速检测。结论本研究以rNP蛋白为靶标,通过人工合成扎伊尔型埃博拉病毒NP蛋白编码基因片段1234～1815 bp,表达重组蛋白rNP作为抗原,制备并筛选出单克隆抗体mAb-rNP-1和mAb-rNP-2,利用上转发光材料修饰与标记抗体,优化、组装上转发光免疫层析快速检测试纸条,并对其敏感性、特异性及定量检测性能评价,建立了扎伊尔型埃博拉病毒的上转发光免疫层析快速检测技术。该技术特异性强,实验结果显示与DV1、CHIKV、ZIKV、JEV均无交叉反应,rNP蛋白检出下限为0.1ng/μL,可进行ZEBOV的定量检测,检测时间15 min,可满足各级疾病预防控制、口岸传染病监控和生物安全防护等需求。