目的:羊水间充质干细胞（AF-MSCs）具有良好的自我再生能力、较强的可塑性以及低免疫原性与低成瘤性,体外生长不易衰老,因此较之成体干细胞具有更好的再生医学前景。然而,由于目前AF-MSCs的体外培养缺乏统一标准,导致其生物学特点存在多样性,各项研究之间缺乏可比性,难以明确不同胎龄来源的AF-MSCs之间的差异,因而阻碍了其在临床的应用。此外,虽然AF-MSCs的形态、增殖及分化的异质性被广泛认知,然而其异质性的起源及异质性引发差异的机制还不甚明了,亟需一些技术手段对此进行分析。而转录组测序是研究特定细胞在某一发育阶段或功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和,能够从整体水平研究基因功能以及基因结构,揭示特定的生物学过程,它已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。因此应用转录组对不同发育阶段AF-MSCs进行研究,可以帮助我们进一步了解不同发育阶段AF-MSCs差异产生的原因,让干细胞治疗更好的有的放矢。研究方法:1.AF-MSCs的分离及培养无菌条件下吸取大鼠E12、E15、E18及E21的羊水,4℃离心（1800转）15分钟,PBS清洗2遍,用含10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞,置于37℃,5%CO2维持湿度的培养箱内。首次换液时间为5天,此后每2-3天换液一次,直至细胞70%汇合度后进行传代操作。细胞传代超过3代认定为提取AF-MSCs成功。2.AF-MSCs鉴定分别按说明书进行表面标志物鉴定、成脂诱导、成骨诱导、成软骨诱导。3.BrdU检测选取P5代细胞铺种于6孔板,当细胞达70-80%汇合度时,检测孔加入20μL 1-mM BrdU溶液于培养箱内孵育4小时,使用BrdU试剂盒处理细胞后用流式细胞仪检测。4.CCK-8增殖曲线取P4代AF-MSCs按1.5×104/孔接种于96孔板,每24小时取一板细胞,使用酶标仪测量450nm处的吸光度。5.Transwell迁移实验选取P4细胞,培养18小时。取出小室,擦去室内细胞,结晶紫溶液染色20分钟,进行拍照。拍照后的小室浸入10%乙酸600μL脱色10分钟,使用酶标仪测600nm处吸光度,吸光度越高代表迁移到小室底面的细胞数越多。6.划痕实验选取P4细胞按2.5×105/孔接种于6孔板。次日,显微镜下观察细胞达70%汇合度,用无菌10μL枪头垂直板底划痕,12小时及24小时选择三个固定位置进行拍照。7.AF-MSCs全转录组测序选择4组AF-MSCs样本（E12、E15、E18和E21）,每组样本3个生物学重复,共12个样本。首先将提取好的total RNA使用生物素标记的特异性探针去除核糖体rRNA。在纯化之后,将RNA片段化,随后使用随机引物和反转录酶合成cDNA一链,然后使用DNA聚合酶I和RNaseH来合成双链的cDNA。双链的cDNA产物随后进行了加“A”碱基和接头连接。连接产物扩增纯化后即得到了最终的cDNA文库。最后将构建好的测序文库利用Illumina HiSeq测序平台进行测序。8.生物信息学分析测序所得数据过滤后使用比对软件HISAT比对到参考基因组Rnor 6.0,之后用软件StringTie、Cufflinks对clean reads进行转录本组装,对于组装得到的新转录本,用三款软件CPC、txCdsPredict、CNCI及一个数据库pfam对新转录本进行编码能力预测,使用软件Bowtie2将clean reads比对到参考序列,之后再使用软件RSEM计算基因和转录本的表达量。使用差异分析软件DEGseq进行组间差异分析,显著差异基因的过滤条件为Fold Change≥2.00及Adjusted Pvalue≤0.001。使用Gene Ontology和KEGG数据库进行差异表达基因的注释。进一步的个性化分析过程如下,将细胞增殖曲线与转录组表达量进行曲线拟合,筛选与增殖相关的差异基因,并使用TargetScan与miRanda进行靶点预测,找到与目标mRNA相互作用的microRNA。9.转染目标基因进行PCR及western检测按转染试剂说明书将目标基因转入细胞,并进行生物学功能（增殖、迁移）观察后,收集细胞提取RNA与蛋白。提取的RNA反转录后进行实时荧光定量PCR检测。提取的蛋白进行western blot实验,10%分离胶、5%浓缩胶电泳2小时,转印与封闭2小时后过夜孵育一抗,第二日室温孵育二抗后ECL发光仪检测。10.双萤光素酶报告基因实验提前一天将293细胞铺于24孔板,第2日的汇合度达到60%,转染双萤光素酶质粒与mimics,共同孵育48小时。使用双萤光素报告基因检测试剂盒检测萤光素酶活性。11.统计分析使用SPSS 17.0软件进行统计学分析,计数资料采用均数±标准差的形式书写。涉及4组样本的比较采用ANOVA检验,方差齐则使用LSD多重比较,方差不齐采用Tamhane检验,2组数据的比较使用独立样本T检验,方差不齐的计数资料采用非参数Mann-Whitney U检验。p<0.05表示差异有显著性。结果:1.E12与E15,特别是E15来源的大鼠AF-MSCs具有良好增殖与迁移能力我们成功收集了125只孕鼠的羊水,各胎龄分配如下:E12,47只;E15,17只;E18,44只;E21,17只。E15培养成功率最高,达到100%的定植传代,其次为E21,成功率最低为E12;E12与E15贴壁细胞出现首个集落的时间为1-3天,远远早于E18与E21的7-10天,而且E12与E15跨跃了“Hayflick Limit”连续传代至60代依旧保持旺盛的增殖能力,而E18与E21的细胞最多传22代。使用CCK-8实验与BrdU检测观察到E12与E15的细胞具有更好的增殖能力;使用划痕实验与Transwell迁移实验观察到E12与E15的细胞具有更好的迁移能力。2.AF-MSCs转录组测序结果12个样本每个样本平均产出12.67Gb数据,基因组的平均比对率为87.26%。总共检测到61,678个转录本表达,其中新的mRNA为7,210个,已知的mRNA为42,396个,新的microRNA平均有593个,已知microRNA平均有112个。3.AF-MSCs可分为早期组（E12与E15）与后期组（E18和E21）将AF-MSCs的mRNA表达谱进行PCA主成份分析,我们发现在PC1轴上E12与E15聚在一侧,而E18与E21聚集在另一侧;同样的,层次聚类分析也可以观察到E12与E15的表达谱更为类似,而E18与E21的表达谱更接近。这样的结果与我们在细胞生物学实验中观察到的不同发育阶段AF-MSCs的增殖及迁移趋势一致,因此,我们将AF-MSCs分为两组:早期组与后期组。对这两组细胞的转录组表达量进行差异分析,我们发现差异基因富集于与细胞分裂、细胞周期或DNA复制等相关的生物学过程或信号通路上,于是我们利用细胞增殖曲线与表达量数据,采用线性相关分析得到一组基因对Abca4/miR-351-3p与细胞增殖相关。此外,为了探讨影响细胞迁移与增殖的潜在调控关系,我们对转录组数据进行了二次分析,因为E15AF-MSCs除了具有增殖优势,还具有易于提取,定植形成的细胞集落出现时间早,迁移快的特点,故将E15设为对照组进行差异分析,并进行GO及KEGG富集分析,我们发现在与细胞增殖有关的生物过程中,E15与E12的差异基因数明显少于E15比E18或E15比E21,因此我们设定了一系列筛选标准,最终筛选出Chrdl1/miR-532-3p及Chrdl1/miR-672-3p两对基因对与细胞增殖及迁移相关。4.miR-351-3p及其潜在靶向增殖相关基因Abca4功能研究通过速率曲线拟合,找到与增殖有关的差异基因Abca4,并利用miRanda软件预测与其CDS区结合的microRNA为miR-351-3p,通过敲入及敲减基因,证实了Abca4具有抑制细胞增殖的特点。并通过敲入与敲减miR-351-3p,观察Abca4的表达出现对应的下调与上调,AF-MSCs表现出对应的增殖增快与减弱的趋势。双萤光素酶报告基因实验证明二者在CDS区域有结合位点。5.miR-532-3p及其潜在靶向增殖与迁移相关基因Chrdl1功能研究通过对差异倍数的筛选,找到Chrdl1为不同发育阶段AF-MSCs的差异基因,通过miRanda软件预测与Chrdl1的3’UTR区结合的microRNA有2个,其中miR-672-3p在RT-qPCR验证中因为表达量与转录组测序数据不符被剔除,miR-532-3p成为唯一入选差异表达microRNA。通过细胞功能学实验证实Chrdl1具有抑制细胞增殖与迁移的作用。通过敲入与敲减miR-532-3p,可以观察到Chrdl1对应的下调或上调,并且AF-MSCs表现出对应的增殖与迁移能力提高与减弱的趋势。双萤光素酶报告基因实验证明二者在3’UTR区域有结合位点。结论:1.大鼠E15胎龄来源的AF-MSCs易于分离提取,成功率高。2.孕早期E12与E15的AF-MSCs较之孕中晚期E18及E21来源的AF-MSCs有更强的增殖与迁移能力,可以作为干细胞治疗的种子细胞。3.孕早期E12与E15的细胞具有相似的转录组表达谱,且孕中晚期的E18与E21具有相似的转录组表达谱,而孕早期与孕中晚期的转录组表达谱具有明显差异。4.miR-351-3p通过靶向Abca4促进AF-MSCs的增殖。5.miR-532-3p通过靶向Chrdl1促进AF-MSCs的增殖与迁移。