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目的:探讨自噬介导的日本脑炎（Japanese encephalitis,JE）DNA疫苗免疫增强效应及机制,为新型JE疫苗的研发提供新的思路。研究方法:1.pJME-LC3的构建及鉴定根据GenBank检索到的小鼠LC3B基因序列,利用RT-PCR法合成LC3B基因,重组至含JEV prME蛋白编码基因的pJME构建重组质粒,命名为pJME-LC3,BamH I/EcoR I双酶切、测序鉴定;脂质体法将pJME-LC3按不同时间、不同浓度转染CHO-K1细胞,western blot法检测prME-LC3融合蛋白的表达;用G418对pJME-LC3转染CHO-K1细胞进行筛选,光镜下观察抗性克隆株的形成,western blot法检测数代稳定转染株细胞中prME-LC3的表达;将pJME-LC3转染至CHO-K1细胞,光镜下观察自噬性细胞集落的形成,透射电镜观察细胞内自噬小体的形成,western blot法检测自噬标志蛋白LC3Ⅱ及底物蛋白p62的表达;用HBAD-GFP-LC3及pJME-LC3处理细胞,间接免疫荧光法标记后通过共聚焦显微镜观察prME-LC3融合蛋白与内源性LC3蛋白在自噬体中共定位。2.动物分组及免疫120只BALB/c鼠随机分为6组,其中pcDNA3.1（+）阴性对照组、pJME常规DNA疫苗对照组、pJME-LC3实验组及药物抑制自噬活性的pJME-LC3+3-MA组给予相应质粒100μg/100μL肌注,其余两组分别接受PBS（100μL肌注）或100μL JEV-L腹腔注射,共免疫3次,每次间隔两周,pJME-LC3+3-MA组从首次免疫开始至末次免疫结束每天加用60μg自噬抑制剂3-MA腹腔注射。3.病毒攻击第一批:每组15只BALB/c鼠共6组,免疫流程同前;第二批:每组20只BALB/c鼠共6组,其中PBS（100μL肌注）,pcDNA3.1（+）、pJME、pJME-LC3及pJME-LC3+3-MA组分别200μg/100μL肌注,JEV-L组100μL腹腔注射,具体免疫流程同前。pJME-LC3+3-MA组从首次免疫开始至末次免疫结束每天加用60μg自噬抑制剂3-MA腹腔注射。末次免疫后3周,小鼠腹腔注射JEV（野生强毒株YN2016-1,105PFU/500μL）进行病毒攻击。4.JE DNA疫苗pJME-LC3免疫效应及机制研究末次免疫后3周,每组20只小鼠断颈处死,无菌取脾脏分离淋巴细胞及DCs。间接免疫荧光法观察prME-LC3融合蛋白在免疫鼠脾脏DCs中的表达;流式细胞术分析免疫鼠脾脏DCs摄取FITC-Dextran能力及CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞亚群;乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测免疫鼠JEV特异性CTL活性;每次免疫后间隔一周及末次免疫后连续三周（第1、3、5、6、7w）采集免疫鼠外周血分离血清,ELISA法检测免疫鼠脾脏淋巴细胞经JEV刺激后分泌细胞因子（IL-4、IL-10、IFN-γ、IL-12）水平及血清样本中JEV特异性IgG1/IgG2a抗体相对滴度;Western blot法检测IFN-γ-JAK2/STAT1-T-bet中信号通路蛋白及下游转录因子T-bet的表达。5.JE DNA疫苗pJME-LC3免疫记忆及保护性免疫研究流式细胞术分析免疫鼠脾脏CD4+/CD8+记忆性T淋巴细胞亚群;攻毒后3周内观察各组小鼠状态及存活数量,并计算存活率;80%空斑减少中和试验（PRNT80）检测免疫鼠血清中和抗体滴度。结果:1.成功构建pJME-LC3测序分析结果显示:JEV prME蛋白及LC3B蛋白编码基因与GenBank检索到的基因序列相符。琼脂糖凝胶电泳显示:pJME-LC3经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切后释出的DNA片段之一与LC3B基因（390bp）大小一致,另两个片段与pJME经相同酶切后释出的基因片段pcDNA3.1（+）（5428bp）及prME（2001bp）大小一致,提示重组质粒pJME-LC3构建成功。2.pJME-LC3编码蛋白在CHO-K1细胞内快速及稳定表达prME-LC3融合蛋白在转染后12h即有大量表达,且随作用时间（12-36h）及质粒浓度（1-4mg/mL）的增加而上升;G418对pJME-LC3转染后抗性克隆株进行筛选,发现pr ME-LC3融合蛋白蛋白能够在数代抗性克隆株细胞内稳定表达而未出现衰减现象。3.pJME-LC3促进CHO-K1细胞自噬活性增加光镜下pJME-LC3组自噬性细胞集落形成明显多于pJME组,作用与Rapamycin相似;透射电镜下pJME-LC3组细胞内自噬小体数量多于pJME组;western blot检测pJME-LC3组自噬标志蛋白LC3 II明显高于pJME组,而作为自噬底物的负性调节蛋白p62的表达则呈相反趋势。4.pJME-LC3编码蛋白与CHO-K1细胞内源性LC3蛋白共定位于自噬体共聚焦显微镜下pJME-LC3组用于标记细胞内源性LC3蛋白的绿色荧光呈颗粒状聚集于胞浆及胞膜,并与红色荧光标记的质粒编码蛋白共定位于自噬体呈现融合的黄色荧光,而pJME组绿色荧光弥散存在于胞浆中,且未与红色荧光融合。5.pJME-LC3促进质粒编码蛋白在免疫鼠脾脏DCs中的表达荧光显微镜下观察发现:作为常规JE DNA疫苗对照的pJME组少量DCs胞浆中可见质粒编码蛋白表达;pJME-LC3实验组大量DCs胞浆中均可见质粒编码蛋白表达;而pJME-LC3+3MA自噬活性抑制组仅有少量DCs胞浆中质粒编码蛋白表达;作为阴性对照的pcDNA3.1（+）空载体组DCs中未见质粒编码蛋白表达。6.pJME-LC3促进免疫鼠脾脏DCs内吞能力pJME-LC3实验组免疫鼠脾脏DCs摄取FITC-Dextran的能力明显强于JEV-L对照组（P<0.05）,作为常规DNA疫苗对照的pJME组（P<0.05）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（P<0.05）,后3组两两之间差异无统计学意义。7.pJME-LC3增加CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞数量pJME-LC3实验组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（45.66±5.04）%,明显高于其它组（P<0.05）;作为常规DNA疫苗对照的pJME组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（37.40±5.23）%,与JEV-L对照组（35.84±2.75）%及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（34.46±3.87）%两两之间无显著性差异;作为阴性对照的pcDNA3.1（+）组CD3+CD4+T淋巴细胞比例为（26.38±4.69）%,与PBS空白对照组（25.25±3.82）%基本一致,均低于其它组（P<0.05）。pJME-LC3实验组CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（30.23±1.43）%,明显高于其它组（P<0.05）;作为常规DNA疫苗对照的pJME组CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（15.89±1.45）%,与JEV-L对照组（15.07±0.96）%及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（13.42±1.58）%两两组间差异无统计学意义;PBS空白对照组CD3+CD8+T淋巴细胞比例为（9.98±1.80）%,与作为阴性对照的pcDNA3.1（+）阴性对照组基本一致,显著低于其它组（P<0.05）。8.pJME-LC3增加JEV特异性CTL活性当设效应靶细胞:靶细胞为10:1时,LDH释放法对不同免疫组小鼠脾细胞JEV特异性CTL活性检测的结果显示:pJME-LC3组CTL杀伤活性为（55.72±2.34）%,显著高于JEV-L对照组（39.43±2.85）%,pJME常规DNA疫苗对照组（37.88±2.47）%及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（28.96±3.21）%,差异有统计学意义（P<0.05）。9.pJME-LC3促进免疫鼠脾脏T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子pJME-LC3实验组T淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ水平为（48.26±5.47）pg/mL,显著高于JEV-L对照组的（19.45±5.76）pg/mL（P<0.01）、pJME常规DNA疫苗对照组（35.09±7.16）pg/mL（P<0.05）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（33.64±4.80）pg/mL（P<0.05）,而后3组中JEV-L组明显低于其它2组,差异均有统计学意义（P<0.05）;PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组IFN-γ水平分别为（5.65±1.28）pg/m L、（7.82±1.94）pg/mL,均低于其它组（P<0.05）。IL-12在pJME-LC3实验组为（62.19±9.75）pg/mL,显著高于作为常规DNA疫苗对照的pJME组（44.61±7.49）pg/mL（P<0.05）、pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（39.88±9.04）pg/mL（P<0.05）及JEV-L对照组（29.64±6.32）pg/mL（P<0.01）,而后3组中JEV-L组明显低于其它2组,差异均有统计学意义（P<0.05）;作为空白对照的PBS组、pcDNA3.1（+）阴性对照组IL-12水平分别为（15.24±4.21）pg/mL、（16.90±6.46）pg/mL,均低于其它组（P<0.05）。细胞因子IL-4、IL-10水平在各组间无显著性差异（P>0.05）。10.pJME-LC3促进JEV特异性IgG2a抗体生成根据各样本孔OD值评估IgG1抗体相对滴度发现:PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组在初次免疫后1、3、5、6、7周无明显变化,均低于其它免疫组,且各时间点两组间无显著性差异;JEV-L对照组、pJME常规DNA疫苗对照组、pJME-LC3实验组及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组IgG1抗体相对滴度均随免疫时间延长逐渐上升,在初次免疫后第1、3、5、6、7周两两组间差异均统计学意义。IgG2a抗体相对滴度自初次免疫后1、3、5、6、7周在PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组均处于低水平,各时间点数值无显著性差异;pJME-LC3实验组IgG2a抗体滴度快速上升,至初次免疫后第7周达到最高值,而JEV-L对照组、pJME常规DNA疫苗对照组及自噬活性抑制的pJME-LC3+3-MA组在初次免疫后1、3、5、6周IgG2a抗体上升速度及绝对值均低于pJME-LC3实验组,且在第7周出现衰减。11.pJME-LC3促进脾脏T淋巴细胞pJAK2、pSTAT1蛋白及转录因子T-bet的表达pJME-LC3实验组免疫鼠脾脏T淋巴细胞中pJAK2、pSTAT1蛋白及转录因子T-bet的表达均显著高于作为减毒疫苗对照的JEV-L组、pJME常规DNA疫苗对照组及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组,差异有统计学意义（P<0.01）;而后3组之间无显著性差异;PBS空白对照组、pcDNA3.1（+）阴性对照组与JEV-L组3种蛋白的表达量无显著性差异。12.pJME-LC3促进BALB/c鼠CD4+、CD8+TCM/TEM比值CD4+TCM/TEM比值在pJME-LC3实验组为（2.34±0.79）,高于pJME常规DNA疫苗对照组（1.93±0.64,P<0.05）、JEV-L对照组（1.58±0.27,P<0.05）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（1.56±2.02,P<0.05）;后3者之间差异无统计学意义;CD4+TCM/TEM在作为空白对照的PBS组（0.94±0.59）与pcDNA3.1（+）阴性对照组（0.99±0.37）中比值基本一致,均低于其它组（P<0.05）。CD8+TCM/TEM比值在pJME-LC3实验组为（0.62±0.30）,高于pJME常规DNA疫苗对照组（0.40±0.29,P<0.05）、JEV-L对照组（0.36±0.13,P<0.05）、pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（0.36±0.21,P<0.05）;而CD8+TCM/TEM比值在PBS空白对照组为（0.28±0.17）与pcDNA3.1（+）阴性对照组的（0.27±0.05）基本一致,均低于其它组（P<0.05）。13.pJME-LC3促进JEV特异性中和抗体快速、持续生成pJME-LC3实验组小鼠血清中和抗体效价早在攻毒前2天即有升高（1:20）,攻毒后14天达到1:160,此外其余各组中和抗体滴度均在攻毒后21天下降,而pJME-LC3实验组未见衰减。提示pJME-LC3免疫组小鼠血清抗体产生速度、效价增长速度、效价绝对值、抗体效价持续时间均优于pJME常规DNA疫苗对照组、JEV-L对照组或pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组。14.pJME-LC3增强对JE BALB/c鼠的保护性免疫用JEV野生强毒株YN2016-1对小鼠进行攻击后第2天,大部分小鼠开始有不同程度的毛色晦暗潮湿、食欲不振、体重减轻等症状,之后陆续出现死亡。至攻毒后第21天,第一批:pJME-LC3实验组存活率为（13/15,86.67%）,高于JEV-L对照组（12/15,80%）,pJME常规DNA疫苗对照组（8/15,53.33%）及pJME-LC3+3-MA自噬活性抑制组（7/15,46.67%）。第二批:pJME-LC3实验组存活率为（91.67±2.36）%,显著高于JEV-L组（81.67±2.36）%,pJME组（61.67±2.36）%及pJME-LC3+3-MA组（56.67±2.36）%。结论:1.构建的pJME-LC3可在体外快速、稳定表达,激活自噬并将prME-LC3融合蛋白传递至细胞自噬途径;2.pJME-LC3促进DCs对prME-LC3融合蛋白的摄取,并通过提高免疫鼠脾CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞数量增强JEV特异性的CTL活性;3.pJME-LC3通过增加Th1型细胞因子分泌水平诱导Th1型细胞免疫应答,同时促进以IgG2a为主体的体液免疫应答;4.pJME-LC3通过IFN-γ-JAK2/STAT1-T-bet途径促进初始CD4+T淋巴细胞向Th1型细胞分化,可成为自噬介导JE DNA疫苗免疫增强效应机制之一;5.pJME-LC3通过增加JEV特异性CD4+、CD8+TCM/TEM比例,诱导长效免疫记忆;6.pJME-LC3通过促进JEV特异性中和抗体的快速、持续生成诱导强效免疫保护。