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目的:在众多的心血管疾病中,氧化应激损伤都扮演着非常重要的角色。氧化应激参与了动脉粥样硬化﹑心肌缺血再灌注损伤﹑高血压﹑心力衰竭等一系列心血管疾病的病理生理过程,同时也是探究心血管疾病的一大热点。泛素化是蛋白质普遍存在的一种翻译后修饰,这种修饰控制着广泛的生物学功能,并对维持生理及疾病中细胞的稳态起到至关重要的作用。许多研究表明,在心血管系统中,氧化应激损伤与泛素化修饰有着千丝万缕的联系。研究方法:1.本实验研究选取HUVEC作为实验对象,通过培养HUVEC并给与H2O2刺激诱导内皮细胞氧化应激损伤,通过CCK-8观察各组间的细胞活力,流式细胞术,ROS活性氧试剂盒检测细胞凋亡水平,West Bolt检测Smurf2和相关凋亡蛋白的表达2.通过质粒转染的方法,将Flag-Smurf2转染进细胞中,同时给与H2O2刺激,通过CCK-8观察各组间的细胞活力,流式细胞术,ROS活性氧试剂盒检测细胞凋亡水平,West Bolt检测Smurf2和相关凋亡蛋白的表达。通过敲减Smurf2同时给与H2O2刺激,通过CCK-8观察各组间的细胞活力,流式细胞术,ROS活性氧试剂盒检测细胞凋亡水平,West Bolt检测Smurf2和相关凋亡蛋白的表达。通过转染Flag-Smurf2和Myc-PARP1同时给与H2O2刺激,通过流式细胞术检测细胞凋亡水平,West Bolt检测相关凋亡蛋白的表达。通过转染Flag-Smurf2,同时给与H2O2和Heclin刺激,通过流式细胞术检测细胞凋亡水平,West Bolt检测相关凋亡蛋白的表达。3.通过免疫共沉淀实验观察Smurf2与PARP1的结合以及结合区域。4.通过过表达和敲减Smurf2并用West Bolt检测PARP1的表达。通过梯度过表达Flag-Smurf2用West Bolt检测内源PARP1的表达。过表达Myc-PARP1和梯度过表达Flag-Smurf2用West Bolt检测外源Myc-PARP1的表达。5.构建Smurf2稳定敲减HUVEC细胞系,构建Smurf2功能位点失活型Smurf2（C716G）质粒。在敲减Smurf2的细胞中重新过表达Flag-Smurf2和Flag-Smurf2（C716G）用West Bolt检测PARP1的表达。通过免疫共沉淀实验观察Smurf2（C716G）与PARP1的相互作用。在过表达和敲减Smurf2的细胞中给与CHX激刺用West Bolt检测PARP1的半衰期变化,以及在过表达和敲减Smurf2细胞中给与MG132用West Bolt检测PARP1的累积。6.通过免疫共沉淀实验观察在MG132刺激下Smurf2与PARP1的相互作用。在过表达Flag-Smurf2细胞中同时给予Heclin用West Bolt检测PARP1的表达。用免疫共沉淀实验观察过表达和敲减Smurf2观察Smurf2对于PARP1的泛素化结果:1.在氧化应激刺激下HUVEC的凋亡水平,细胞内的ROS水平,Smurf2的表达以及凋亡相关蛋白cleaved PARP1和cleaved caspase3的表达随着氧化应激损伤的加重而增加,同时,HUVEC的细胞活力下降。2.在HUVEC中过表达Flag-Smurf2并给与H2O2刺激,HUVEC的凋亡水平,细胞内的ROS水平,凋亡相关蛋白cleaved PARP1和cleaved caspase3的表达较空载组下降,对应的细胞活力较空载组提高。进一步,我们筛选出最佳的si-RNA片段并在HUVEC中敲减Smurf2并给与H2O2刺激,HUVEC的凋亡水平,细胞内的ROS水平,凋亡相关蛋白cleaved PARP1和cleaved caspase3的表达较对照组升高,其细胞活力较对照组下降。在HUVEC中分别过表达Flag-Smuf2,Myc-PARP1以及共同过表达Flag-Smuf2,Myc-PARP1并给与H2O2刺激,过表达PARP1增加了HUVEC的凋亡水平以及凋亡相关蛋白cleaved PARP1和cleaved caspase3的表达,但同时过表达Smurf2可以缓解PARP1加重的HUVEC的凋亡水平,以及凋亡相关蛋白cleaved PARP1和cleaved caspase3的表达。在HUVEC中过表达Flag-Smurf2并给与Smurf2的抑制剂:Heclin,在H2O2刺激下,Heclin阻断了Smuf2对HUVEC的保护作用,HUVEC的凋亡水平,以及凋亡相关蛋白cleaved PARP1和cleaved caspase3的表达增加。3.免疫共沉淀实验证实Smurf2与PARP1的相互作用以及在氧化应激刺激下两者的相互作用增强,同时,确定两者之间的结合区域。4.过表达Flag-Smurf2可以降低PARP1的表达,反之,敲减Smurf2可以增加PARP1的表达。构建HUVEC的Smurf2的稳定沉默细胞株,同样得到敲减Smurf2可以增加PARP1的表达。梯度过表达Flag-Smurf2,PARP1的表达逐渐减少。梯度过表达Flag-Smurf2并同时过表达Myc-PARP1,发现Myc的表达量逐渐减少。5构建Smurf2功能位点失活型Smurf2（C716G）,在Smurf2稳定沉默的细胞中重新过表达Flag-Smurf2和Flag-Smurf2（C716G）发现,Smurf2位点失活后失去了对PARP1表达量的影响。同时,通过免疫共沉淀实验发现过表达Smurf2（C716G）减弱了Smurf2与PARP1的相互作用。在过表达Flag-Smurf2的细胞中给与CHX（0,4,8h）发现内源性PARP1的半衰期比空载体组缩短。在沉默Smurf2的细胞中给与CHX（0,4,8h）发现敲除Smurf2内源性PARP1的半衰期比对照组延长。在过表达Flag-Smurf2同时过表达Myc-PARP1的细胞中给与CHX（0,4,8h）发现外源Myc的半衰期较空载组缩短。在过表达Flag-Smurf2的细胞中给与MG132（0,4,8h）发现MG132可以阻断Smurf2介导的PARP1的负性调控,在敲除Smurf2的细胞中给与MG132（0,4,8h）发现内源性PARP1的积累更为明显。6.通过免疫共沉淀实验发现MG132可以增强Smurf2与PARP1的相互作用。在过表达Flag-Smurf2给与MG132和Heclin发现Heclin阻断了Smurf2对于PARP1的负性调控。通过免疫共沉淀实验发现过表达Flag-Smurf2可以增强PARP1的泛素化,但过表达Flag-Smurf2（C716G）使得PARP1的泛素化减弱。在稳定敲减Smurf2的细胞中重新过表达Flag-Smurf2得到上述相同结果。结论:实验证明,Smurf2,作为一种E3泛素化连接酶,参与了氧化应激诱导的HUVEC凋亡,并抑制了H2O2诱导的ROS生成以及HUVEC的凋亡。与此同时,我们发现Smurf2可以结合PARP1,并通过泛素-蛋白酶体途径降解PARP1。因此,Smurf2通过泛素-蛋白酶体途径降解过度激活PARP1抑制了氧化应激诱导的HUVEC凋亡。