目的:乳腺癌是常见的恶性肿瘤之一。占女性癌症的1/4,严重威胁女性健康及生活质量。根据2021年全球癌症研究最新数据,女性恶性肿瘤中乳腺癌的发生率约30%,占第1位,病死率达15%,在癌症相关死亡中为第2位。目前,乳腺癌综合治疗迅猛发展,各大手段能够有效清除肿瘤组织,延缓病情发展,延长患者的生存时间。但是患者预后还受其他诸多因素影响。在过去的几十年里,基于乳腺癌分子水平的研究取得了重大进展,如BRCA1、BRCA2等与疾病发展相关的基因,它们产生肿瘤抑制蛋白并参与DNA损伤修复。于分子层面研究肿瘤细胞增殖、侵袭转移的机制,以指导预测乳腺癌预后、判断耐药以及发掘作为治疗靶点或及预后指标的新型标志物尤为重要。目前研究证实,E2F3基因的扩增和过表达是人类肝细胞肝癌发生过程中的一个致癌事件,在乳腺癌中,也有促进癌细胞侵袭转移及上皮间质转化的作用。E2F3作为转录激活因子,在鼻咽癌、恶性黑色素瘤、结肠癌、胃癌、前列腺、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌中存在基因的扩增或过表达,促进肿瘤的侵袭与转移且与疾病预后明显相关。基于Curtis数据库及TCGA数据库分析显示,在浸润性导管癌中,E2F3的表达均明显高于正常组织,在浸润性小叶癌中,E2F3的表达也明显升高,且E2F3的高表达的患者总生存（Overall survival,OS）、无进展生存（Progression-free Survival,PFS）、无远转生存（Distal metastasis-free survival,DMFS）及进展后生存（Post-progression survival,PPS）更短。乳腺癌治疗瓶颈,在于肿瘤细胞DNA损伤修复能力大小及肿瘤细胞干细胞样特性高低。这些都会导致肿瘤对治疗手段的抵抗。本研究的目的为探讨E2F3在乳腺癌发生发展中的重要作用,明确其介导的信号通路,并确认E2F3在乳腺癌疾病进程中发挥效应功能的分子调控途径。探讨E2F3在乳腺癌细胞中的促干细胞样作用、对细胞周期的调控以及其对X线及化疗药物抵抗的影响。通过检测γ-H2AX在转染乳腺癌细胞核中的募集,探索E2F3在乳腺癌细胞DNA损伤修复中的作用。以期通过分子途径提高乳腺癌的诊断,判断预后以及指导制定合理的临床诊疗方案。研究方法:1.通过TCGA及Curtis数据库分析乳腺癌肿瘤组织中E2F3表达情况及其与乳腺癌患者预后的相关性。2.检测E2F3在乳腺癌临床组织样本中的表达情况:选择经病理组织学证实为乳腺癌的临床样本20例,癌旁组织样本10例。采用免疫组化的方法,检测E2F3在样本中的表达情况。3.探索E2F3对乳腺癌MDA-MB-231及MCF-7细胞的干性调控作用:E2F3sh RNA慢病毒转染MDA-MB-231及MCF-7细胞,基因敲减率通过Real-time PCR及Western blot实验技术证实。在CCLE数据库中分析E2F3与肿瘤细胞干性相关指标CD133、EPCAM、ALDH1A2及POU5F1的相关性;通过Real-time PCR实验检测E2F3敲减的细胞系中,与干细胞样特性相关指标CD133、EPCAM、ALDH1A2及POU5F1 m RNA的表达情况;应用流式细胞仪检测E2F3敲减后的细胞中ALDH的表达情况;采用成球实验,检测E2F3对肿瘤细胞成球率的影响,判断其对肿瘤细胞干细胞样特性的影响。4.探索E2F3对乳腺癌细胞增殖及周期的影响:在E2F3慢病毒转染的细胞系中,通过Real-time PCR实验检测与DNA复制相关指标POLE2、RFC4、MCM4和GINS1 m RNA的表达情况;通过Western blot技术检测与细胞核复制相关的PCNA及与细胞周期S期进入相关的Cyclin E2、Cyclin A2、CDK2、P21蛋白表达情况;通过流式细胞技术,检测转染细胞的细胞周期分布;通过CCK-8实验分别检测0、24、48、72、96h E2F3稳转细胞系的OD值,判断E2F3对乳腺癌细胞增殖能力的影响。5.探索E2F3介导乳腺癌细胞对化疗药物及X线治疗敏感性的影响:通过CCK-8实验,检测转染细胞对顺铂（Cisplatin）、阿霉素（Adriamycin）及奥拉帕尼（Olaparib）的敏感性;E2F3转染细胞经4、8、12、16MV X线照射后,通过CCK-8实验评估转染细胞对X线敏感性的高低。6.探索E2F3对乳腺癌细胞DNA损伤修复能力的影响:通过Western blot实验,检测在E2F3转染的乳腺癌细胞系中RAD51、BRCA1的表达情况;通过Real-time PCR实验检测与DNA损伤修复相关因子RAD51、BRCA1、BRCA2、EXO1 m RNA的表达水平。采用免疫荧光技术,于共聚焦显微镜下观察经Adriamycin及6MV X线照射处理12、24h后,细胞核中γ-H2AX募集情况。7.检测FOXM1与E2F3表达之间的关系:通过Western blot实验技术,检测E2F3转染的细胞中FOXM1的表达情况。应用FOXM1过表达质粒转染E2F3稳转细胞,通过Western blot实验检测转染后的细胞中FOXM1的表达情况。通过Real-time PCR实验检测检测在FOXM1过表达的sh E2F3细胞中与肿瘤细胞干细胞样特性相关的指标CD133、EPCAM、ALDH1A2及POU5F1 m RNA表达情况;通过CCK-8实验,检测FOXM1过表达的细胞在0、24、48、72、96h OD值,绘制细胞增殖曲线,评价FOXM1对细胞增殖的影响。用流式细胞仪检测FOXM1过表达细胞的细胞周期分布;同时用Western blot实验检测与S期进入相关的因子Cyclin E2、Cyclin A2、CDK2、P21的蛋白表达情况;在FOXM1过表达的细胞中,应用免疫荧光技术检测经6MV X线照射后,12、24h细胞核中γ-H2AX募集,评估FOXM1在细胞对X线敏感性方面的影响;应用CCK-8实验,检测经不同浓度Cisplatin、Adriamycin及Olaparib处理过的FOXM1过表达细胞的OD值,评估FOXM1过表达细胞对三种药物的敏感性。8.探索YTHDF2对E2F3的调控:应用YTHDF2敲减质粒转染MDA-MB-231细胞,通过Western blot实验检测YTHDF2表达,同时检测在转染细胞中E2F3蛋白表达情况。转染细胞经6MV X线照射后,在12、24h分别应用免疫荧光技术,检测细胞核中γ-H2AX募集情况;采用CCK-8实验技术,检测经不同浓度Cisplatin、Adriamycin及Olaparib处理过的转染细胞OD值,以及经4、8、12、16MV X线照射后转染细胞的OD值,评估其对三种化学药物及对X线的敏感性;利用Real-time PCR实验分别检测应用放线菌素D处理后的转染细胞在0、3、6h E2F3 m RNA的表达水平,评估YTHDF2的敲减对E2F3 m RNA衰减的影响;应用RIP实验技术,检测E2F3 m RNA与YTHDF2蛋白之间的关系。9.探索YTHDF2通过METTL14 m6A修饰调控E2F3:应用METTL14 sh RNA慢病毒转染MDA-MB-231细胞,应用Western blot实验技术检测METTL14的表达,同时检测在该转染细胞中E2F3蛋白的表达情况;利用Real-time PCR技术,分别检测经放线菌素D处理过的转染细胞在0、3、6h E2F3 m RNA的水平;采用RIP实验,通过Real-time PCR实验检测YTHDF2蛋白与E2F3 m RNA之间的关系。结果:1.通过TCGA及Curtis数据库分析发现,E2F3 m RNA的表达水平在浸润性导管癌、浸润性小叶癌、导管原位癌、髓样癌、粘液样癌及男性乳腺癌中均明显高于正常组织。通过免疫组化检测方法,检测20例乳腺癌组织样本与10例癌旁组织,结果发现两组标本中E2F3的表达具有明显差异。2.E2F3表达水平与乳腺癌患者的总生存（OS）、无远转生存（DMFS）、进展后生存（PPS）、无复发生存（RFS）有明显的相关性。3.E2F3促进乳腺癌细胞增殖。CCK-8实验证实E2F3敲减的乳腺癌细胞增殖速率下降。4.E2F3促进乳腺癌细胞S期进入。在E2F3敲减的细胞中,与细胞周期复制相关指标POLE2、RFC4、MCM4和GINS1 m RNA的表达均明显下降;PCNA蛋白表达明显下降;E2F3敲减后,与细胞周期S期进入相关的Cyclin E2、Cyclin A2、CDK2蛋白均明显下降;CDK2抑制因子P21蛋白的表达明显增加。与对照组相比,E2F3敲减的细胞中,细胞周期分布G1期比例明显增多,S期细胞比例明显下降。5.E2F3促进乳腺癌细胞产生干细胞样特性。在CCLE数据库中分析E2F3与干细胞样特性相关的指标发现,E2F3与CD133、EPCAM、ALDH1A2及POU5F1具有明显的相关性。在sh E2F3的细胞系中应用Real-time PCR实验检测CD133、EPCAM、ALDH1A2及POU5F1 m RNA水平。证实随E2F3敲减,干细胞样特性相关指标m RNA表达水平均明显下降。应用流式细胞检测技术检测,证实在E2F3敲减后的细胞中ALDH阳性率较对照组明显减少。成球实验中发现相较于对照组,E2F3敲减的细胞成球率明显下降。6.E2F3促进乳腺癌细胞DNA损伤修复。通过Western blot实验证实,在E2F3敲减的细胞中,与DNA损伤修复有关的指标RAD51、BRCA1的表达均明显下降。转染的细胞经Adriamycin及6MV X线照射处理12、24h后,在共聚焦显微镜下观察发现,相比于对照组,E2F3敲减的细胞核中γ-H2AX募集明显增加,说明E2F3敲减后乳腺癌细胞DNA损伤修复能力下降。7.E2F3诱导乳腺癌细胞化疗抵抗。通过CCK-8实验,在sh Ctrl及sh E2F3细胞中分别加入不同浓度的Cisplatin、Adriamycin及Olaparib,发现相比于对照细胞,E2F3敲减的细胞对三种化疗药物更敏感,细胞增殖率明显下降。说明E2F3诱导乳腺癌细胞产生化疗抵抗。8.E2F3诱导乳腺癌细胞产生放疗抵抗。应用4、8、12、16MV X线照射sh Ctrl及sh E2F3转染细胞,发现相对于sh Ctrl,sh E2F3敲减细胞增殖速率明显下降。说明E2F3参与乳腺癌细胞产生放疗抵抗。9.E2F3调控FOXM1。应用FOXM1过表达质粒转染sh E2F3细胞。通过检测0、24、48、72、96h的OD值,发现FOXM1过表达细胞的增殖能力明显高于对照组。检测与细胞S期进入及增殖相关的指标,发现随FOXM1表达增多,PCNA、Cyclin E2、Cyclin A2、CDK2表达明显增多,P21表达明显减少。相较于对照组,FOXM1过表达的细胞G1期比例减少,S期比例明显增多。FOXM1过表达的细胞经X线处理12、24h后,在共聚焦显微镜下观察发现,相较于OE-Ctrl组细胞,FOXM1过表达的细胞核内γ-H2AX募集明显减少,说明FOXM1基因促进细胞DNA损伤修复。应用Cisplatin、Adriamycin及Olaparib处理过的FOXM1过表达细胞增殖率明显高于对照组细胞。说明FOXM1诱导乳腺癌细胞产生化疗抵抗。检测与肿瘤干细胞样特性相关指标发现,在FOXM1过表达的细胞中,CD133、EPCAM、ALDH1A2及POU5F1 m RNA表达均明显升高。通过成球实验,发现FOXM1过表达的细胞相较于对照组细胞,其成球能力明显升高,肿瘤球数量增多,体积明显增大。10.YTHDF2通过METTL14 m6A修饰调控E2F3。应用YTHDF2质粒转染MDA-MB-231细胞,通过Western blot实验检测转染细胞中E2F3及FOXM1的表达情况,发现YTHDF2敲减导致E2F3及FOXM1蛋白表达明显减少。通过RIP实验检测MDA-MB-231细胞,发现YTHDF2蛋白与E2F3 m RNA明显相关。应用Real-time PCR实验检测应用放线菌素D处理后的细胞在0、3、6h E2F3 m RNA的水平,发现随时间延长,转染细胞中E2F3 m RNA半衰期明显缩短。转染细胞经6MV X线照射后,分别于12、24h应用免疫荧光技术检测细胞核中γ-H2AX募集。发现YTHDF2的敲减可以增加γ-H2AX募集,证实YTHDF2可以促进乳腺癌细胞DNA损伤修复。应用不同浓度Cisplatin、Adriamycin及Olaparib处理YTHDF2转染的细胞,以及应用4、8、12、16MV X线照射YTHDF2转染的细胞,通过绘制细胞增殖曲线,发现YTHDF2可以诱导乳腺癌细胞产生放化疗抵抗。应用METTL14 sh RNA慢病毒转染MDA-MB-231细胞,并通过Western blot实验检测转染细胞中E2F3表达水平,发现METTL14与E2F3明显相关。应用放线菌素D处理转染后的细胞,分别于0、3、6h检测E2F3 m RNA的水平,发现sh METTL14细胞E2F3 m RNA衰减加速。通过RIP实验再次在sh METTL14细胞中证实YTHDF2与E2F3 m RNA具有相关性。结论:1.E2F3促进乳腺癌细胞增殖、S期进入、DNA复制,增加乳腺癌细胞干细胞样特性,促进乳腺癌细胞DNA损伤修复。2.E2F3诱导乳腺癌细胞产生放化疗抵抗。3.E2F3通过调控FOXM1促进乳腺癌细胞增殖、干细胞样特性、DNA损伤修复及诱导乳腺癌细胞产生放化疗抵抗。4.YTHDF2通过METTL14 m6A修饰调控E2F3,增加乳腺癌细胞DNA损伤修复能力及诱导乳腺癌细胞产生放化疗抵抗。5.YTHDF2-E2F3-FOXM1通路可以作为克服乳腺癌放化疗抵抗的靶点。