水稻黄矮病毒（Rice yellow stunt virus,RYSV）是目前发现的唯一水稻核型弹状病毒,该病毒在自然界中由黑尾叶蝉（Nephotettix cincticeps）以持久增殖型的方式进行传播。方荣祥院士团队在植物系统上证实RYSV编码的P3蛋白为植物细胞间运动蛋白,P6蛋白为植物基因沉默抑制子,但是这两个非结构蛋白在病毒侵染介体昆虫时的定位和功能还未探索。本研究利用昆虫培养细胞对P3和P6在病毒侵染过程中的亚细胞定位和功能进行了初步的探索。为能在介体黑尾叶蝉培养细胞中瞬时表达RYSV编码的各个蛋白,通过定位和克隆黑尾叶蝉肌动蛋白（actin）的启动子（promoter）序列,构建了基于黑尾叶蝉actin promoter的瞬时表达载体pNCGFP-N1。通过优化细胞转染条件,成功在N.cincticeps、二条黑尾叶蝉（Nephotettix virescens）、电光叶蝉（Recilia dorsalis）和草地贪叶蛾（Spodoptera frugiperda）等昆虫培养细胞中表达了绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）,首次开发建立了在叶蝉细胞中高效瞬时表达载体系统。利用该系统在介体培养细胞中对RYSV编码的各个蛋白的亚细胞定位进行研究。结果表明,核衣壳蛋白（N）、磷酸化蛋白（P）、基质蛋白（M）和P6定位在细胞核中,P3呈颗粒状分布在细胞质中;糖蛋白（G）弥散分布在细胞质。基于P3在健康介体叶蝉培养细胞中的定位,我们对该蛋白在病毒侵染的培养细胞中的定位和功能开展了进一步的探索。首先我们制备了 P3特异性抗体,并利用免疫荧光标记技术明确了 P3在RYSV侵染黑尾叶蝉培养细胞中的定位。结果显示,P3在病毒侵染后第18 h呈颗粒状分布于细胞质,36-48 h开始在细胞核外周和细胞核内分布,72 h大部分集中在细胞核内。由此我们猜测P3可能在介体昆虫细胞核内发挥功能,且P3的入核需要其他蛋白的辅助。我们通过杆状病毒表达系统研究P3与RYSV编码的其他蛋白的关系时发现,P3与N和M有共定位。在单独表达时,P3定位在细胞质,N定位在细胞核,M呈小突起状结构定位在细胞膜上;当P3与N共表达时,P3进入核内与N发生共定位;P3与M共表达时,M由细胞膜移动到胞质与P3发生共定位。此外,P3与N和M在RYSV侵染的黑尾叶蝉培养细胞中发生共定位。酵母双杂交技术证实了 P3与N和M的互作。以上结果表明,P3通过与N的相互作用进入细胞核并行使其功能;P3与M互作改变了 M的细胞定位使其从细胞膜移动到核膜。由此推测P3可能参与病毒的复制与病毒粒体的组装过程。利用叶蝉细胞瞬时表达系统和免疫荧光标记技术对RYSV P6在介体黑尾叶蝉培养细胞中的定位和功能进行了探索,结果显示无论是在健康或经RYSV侵染的介体培养细胞中,P6都定位于细胞核中。通过叶蝉瞬时表达载体系统、免疫荧光标记技术和酵母双杂交技术发现P6和N及P在叶蝉细胞核存在共定位,且P6与N,P6与P之间存在互作。因此我们推测P6可能在病毒侵染介体昆虫过程参与病毒复制,即与N和P共同参与病毒复制场所-病毒原质（viroplasm）的组成。为了明确P6是否参与了 RYSV病毒的复制,我们利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术对P6基因进行敲除,通过免疫荧光标记技术和RT-qPCR方法对RNAi结果进行检测,qPCR结果显示抑制P6基因表达后,N和P基因的转录水平明显降低,该结果进一步证实了 P6与N、P一起参与了 RYSV在介体昆虫内的复制过程。综上所述,本研究开发了首个叶蝉细胞瞬时表达系统,利用该系统结合稳定的叶蝉培养细胞平台、杆状病毒表达系统、免疫荧光标记技术、酵母双杂交技术和RNAi技术等,对RYSV的非结构蛋白P3和P6在昆虫细胞中的定位和功能进行了初步研究,证实该两个非结构蛋白在介体昆虫中发挥的作用不同于植物。该研究结果将为深入研究植物弹状病毒与介体昆虫的互作机制提供新的思路,为开发新的抗病策略提供理论参考。