目的：　　 创伤后应激障碍(Posttraumatic stress disorder, PTSD)又称延迟性创伤后应激障碍心因性反应(delayed psychogenic reaction)，是指突发性、威胁性或灾难性生活事件（如地震、海啸、洪灾等）导致个体延迟出现和长期持续存在的精神障碍，其临床表现以再度体验创伤为特征，并伴有情绪的易激惹和回避行为，其诊断始见于1980年出版的美国精神障碍诊断与统计手册第三版(DSM-Ⅲ)。简而言之:PTSD是一种创伤后心理失平衡状态，发病率高、病程长、难以治愈、并且严重影响患者的生活质量和社会稳定。随着突发性灾难事件逐渐增多，以及恐怖组织爆炸、自杀事件不断发生，PTSD受到越来越多学者的关注。关于PTSD发病机制的探讨已涉及创伤学、神经生物学、心理学、神经精神病学等多个学科领域。　　 应激（包括躯体应激和心理应激）与神经内分泌关系密切，应激后激发下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamo-pituitary-adrenal axis，HPA axis)，下丘脑促皮质激素释放激素(Cortieotropin releasing hormone，CRH)释放增多，促进垂体分泌促肾上腺皮质激素(adrenocorticotmphic hormone，ACTH)，进而促进肾上腺皮质分泌糖皮质激素(glucocorticoid, GC)。研究发现，PTSD不同于-般的应激反应及其它精神性疾病，PTSD患者存在持续低水平皮质醇反应和一定程度的海马、杏仁核及前额皮质(medial prefrontal cortex，mPFC)等的影像学及形态学改变，本课题组前期研究已报道，PTSD大鼠mPFC神经元出现了细胞凋亡的改变，导致mPFC结构改变、体积缩小，引起功能下降，与PTSD的发病机制有一定关系。　　 Β-catenin为原癌基因编码的黏附蛋白，调节细胞间的黏附，影响细胞组织形态结构;β-catenin还是Wnt信号传导通路的核心蛋白，研究表明，β-catenin/Wnt信号传导过程发生异常或障碍，会导致细胞生长、分化、代谢及生物学功能异常，从而引起各种疾病甚至肿瘤。Β-eatenin蛋白调控细胞生长增殖的关键环节，在哺乳动物的神经发育过程中起着重要作用。该蛋白在一些神经精神疾病中会发生改变，如精神分裂症、老年痴呆等，参与调节神经元功能。近年来研究发现，β-catenin/Wnt信号通路可通过β-catenin/Tcf蛋白的转录及抑制线粒体释放细胞色素C来调节细胞凋亡。　　 细胞凋亡(apoptosis)，又称程序性细胞死亡，是细胞循自身程序结束其生命的主动性死亡过程。细胞凋亡是一种由多基因控制的、细胞有目的性、有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。细胞凋亡伴随着一系统形态学变化，细胞核中的染色质逐渐固缩和裂解，并聚集在核膜周边呈半月形，进而核仁裂解，胞膜内陷，细胞质中出现有膜包被、含有部分细胞器的凋亡小体，多数凋亡小体可含有部分细胞核成分。研究证实，细胞骨架蛋白的变化势必会影响细胞功能，并有可能启动神经元的自杀程序，引起凋亡。　　 文献显示，整合素(Integrin)在脑内主要表达于神经元中，参与中枢神经系统许多生理功能及病理过程，与疾病的发生有一定关系。整合素主要介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质(extracellular matrixc，ECM)之间的粘附，缺少整合素介导的粘附作用，会引发细胞凋亡，与整合素相关的磷酸化作用、钙内流改变及基因表达改变都与凋亡的诱发有关。在神经退行性疾病中，整合素αv(Integrinav)与突触功能紊乱、可塑性变化及长时程增强抑制、神经元的死亡与再生等密切相关。纽蛋白(Vinculin)是黏着斑的主要黏着蛋白，是构成ECM与细胞骨架蛋白的联系纽带，也是信号转导途径的重要部位。纽蛋白可激活ECM和细胞骨架蛋白之间的由整合素介导的信号传导通路，调节包括神经元在内等众多细胞的生理功能。研究证实，纽蛋白高表达可以使黏着斑结构稳定，降低细胞移位，而纽蛋白表达降低时，整合素和细胞蛋白骨架之间的机械强度降低，黏着斑减少，细胞出现移位。缝隙连接蛋白43(Connexin43)是缝隙连接通道的主要分子，细胞与细胞之间通过缝隙连接蛋白介导的通讯连接进行着物质、能量和信息的交换，对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖、分化和凋亡等生理过程起着重要的调控的作用。细胞间可通过缝隙连接通讯影响细胞凋亡，这一效应可能是凋亡启动信号通过缝隙连接转运而被扩散，从而加速凋亡的散布。　　 凋亡是多基因严格控制的过程，目前已知凋亡过程中伴随着一系列凋亡相关基因的表达，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等，其中Bcl-2家族蛋白是在细胞凋亡过程中起关键性作用的一类蛋白质，Bax和Bcl-2在细胞凋亡的调控中发挥着重要的作用，被认为是细胞凋亡调控的最后通路之一。Bcl-2表达水平较高时，形成Bcl-2/Bcl-2同源二聚体，抑制细胞凋亡，而Bax作为Bcl-2的同源体，是Bcl-2家族中最具有促进凋亡特征的基因。近年的研究提示Bcl-2与Bax调节细胞凋亡，不仅取决于自身表达的高低，还与Bcl-2/Bax比值有关， Bcl-2/Bax比值决定了在创伤刺激下细胞是否进入凋亡。　　 “单一连续刺激(single prolonged stress，SPS)”动物模型是目前探讨PTSD发病机制的较理想的实验模型，该方法已经被国际所认同。研究发现，经过SPS方法建立PTSD大鼠模型，在生理和行为上表现出与PTSD患者很强相似性，存在HPA轴的紊乱、负反馈抑制增强、听觉惊吓反应增强、条件性恐惧反应持续存在、空间记忆受损等。　　 实验方法　　 1、采用SPS方法建立PTSD大鼠模型，随机分为5组，即正常对照组、SPS刺激后1d、4d、7d和14d组;　　 2、测定大鼠体重曲线和血清皮质酮(Corticosteron，CORT)浓度;　　 3、应用透射电镜技术、Hoechst33342荧光染料染色和原位缺口末端标记法检测PTSD大鼠mPFC神经元凋亡变化;　　 4、应用免疫组织化学技术检测β-catenin、 Integrinav、Vinculin、Connexin43、Bcl-2和Bax的表达;　　 5、应用免疫荧光双标染色技术检测Bcl-2和Bax共表达;　　 6、Western Blotting方法检测Integrinatv、Vinculin、 Connexin43、Bcl-2和Bax的表达;　　 7、RT-PCR法检测Integrinαv、Connexin43、Bcl-2和Bax的表达。　　 结果：　　 一、PTSD大鼠体重生长曲线和血清CORT的测定　　 SPS刺激后，大鼠出现精神萎靡，倦卧少动，皮毛稀松干涩无光泽，食欲减退，体重下降等，大鼠还出现易激惹、厮打行为多、大便稀溏等现象。PTSD大鼠血清CORT浓度呈现先增高后降低的变化趋势。　　 二、PTSD大鼠mPFC神经元凋亡的检测　　 1、透射电镜观察凋亡细胞　　 SPS刺激后，部分神经元出现细胞凋亡的改变。早期可见核染色质凝聚，形成新月形团块，沿核膜排列，进而可见细胞核固缩，核膜内陷，部分核裂解，可见凋亡小体。　　 2、TUNEL染色结果　　 PTSD大鼠mPFC中TUNEL阳性细胞数量明显多于正常对照组，且凋亡细胞数量随着时间的延长而逐渐增多，于SPS刺激后7d达高峰，之后逐渐减少。　　 三、PTSD大鼠mPFC中β-catenin的表达变化　　 β-catenin阳性产物在正常大鼠mPFC神经元内呈弱阳性反应;SPS刺激后，β-catenin表达显著降低，明显低于正常对照组。　　 四、PTSD大鼠mPFC中Integrinav、 Vinculin和Connexin43的表达变化　　 1、免疫组织化学结果　　 Integrinav和Vinculin阳性产物在正常大鼠mPFC神经元内呈弱阳性反应，SPS刺激后ld，Integrinav表达显著降低，随后表达开始增加，SPS刺激后7d达到高峰;Vinculin在SPS刺激后4d表达达到高峰，随后开始降低，Integrinαv和Vinculin在SPS刺激后14d表达均明显低于正常对照组。正常大鼠mPFC内Connexin43呈弱阳性反应，主要表达于星形胶质细胞的胞膜和胞质，SPS刺激后，1d、4d表达显著增强，7d达到高峰，随后开始降低，SPS刺激后14d仍高于对照组。　　 2、Western blotting检测结果　　 与正常对照组相比，SPS刺激后，Integrinav蛋白表达出现先减低后增高，随后逐渐下降，Vinculin蛋白表达于SPS刺激后ld表达明显增加，4d时表达最多，随后逐渐下降，但仍高于正常。SPS刺激后，Connexin43蛋白水平明显上调，蛋白表达随时间变化与RT-PCR检测mRNA变化一致。　　 3、RT-PCR检测结果　　 SPS刺激后，Integrinαv表达明显下降，4d出现恢复性上调，7d达到高峰，随后开始降低，SPS刺激后14d低于对照组。Connexin43于SPS刺激后表达逐渐增高，7d达到高峰，随后开始下降。　　 五、PTSD大鼠mPFC中凋亡相关基因Bcl.2和Bax的表达变化　　 1、免疫组织化学结果　　 Bcl-2和Bax在正常大鼠mPFC神经元内呈弱阳性反应，染色较浅。SPS刺激后，Bcl-2在1d、4d表达显著增强，随后开始降低，Bax在SPS刺激后1d表达逐渐增强，7d达到高峰，随后开始降低。与对照组比较，Bcl-2/Bax比值先增高，随后又逐渐降低。　　 2、免疫荧光双标结果　　 激光共聚焦显微镜扫描结果显示，Bcl-2和Bax在mPFC神经元胞膜和突起均有着色。在SPS刺激后4d，两者表达均较强。　　 3、Westem Blotting分析结果　　 与正常对照组相比，模型组Bcl-2和Bax蛋白水平均明显上调。PTSD早期，Bcl-2蛋白表达明显增强，于SPS刺激后4d达到高峰，此时显色最深;SPS刺激后7d表达下降，以后逐渐恢复。Bax蛋白于SPS刺激后7d达到高峰，之后表达逐渐减弱。与正常对照组相比，模型组Bcl-2/Bax比值逐渐减小，于SPS刺激后7d降至最低。　　 4、RT-PCR检测结果　　 正常大鼠mPFC神经元中Bcl-2和Bax mRNA均有一定表达，SPS刺激后表达均明显增高。Bcl-2 mRNA于SPS刺激后4d达到高峰，7d开始下降;SPS刺激后，Bax mRNA水平逐渐增高，7d达到高峰，之后减弱。　　 结论：　　 1、PTSD大鼠mPFC神经元出现凋亡变化，导致mPFC结构改变、体积减小，从而引起功能下降，与PTSD的发病机制有一定关系。　　 2、PTSD大鼠神经元整合素、缝隙连接蛋白及纽蛋白的表达变化与mPFC神经元的细胞凋亡相关。　　 3、凋亡相关基因Bcl-2和Bax含量增加以及两者比值的失衡可能是导致PTSD大鼠mPFC神经元发生凋亡的重要机制。