目的:复方丹参方是治疗血瘀性冠心病的常用中药制剂,具有确切的抗动脉粥样硬化(AS)作用,但分子作用机制研究尚待深入。动脉粥样硬化是常见的心血管疾病之一,被认为是一种慢性炎症性疾病,各种炎性刺激因素在其病程中起促进作用。本研究基于AS的炎症反应学说,研究了复方丹参方中活性单体及成分组合对血管内皮细胞的保护作用,以期阐明该方在血管内皮细胞水平抗动脉粥样硬化的分子作用机制。方法:本研究中采用原代培养的方式培养了人脐静脉内皮细胞(HUVEC),运用全基因表达芯片技术,观察了肿瘤坏死因子(TNF-α,2ng/ml,12小时)刺激后HUVEC全基因组DNA表达的变化情况以及原儿茶醛(PCA)的作用,并选取芯片数据差异明显且与动脉粥样硬化密切相关的基因,通过RT-PCR方法验证了芯片结果的可靠性。选用脂多糖(LPS,0.5μg/ml,12小时)诱导HUVEC炎症反应,以细胞间黏附分子(ICAM-1)、内皮细胞黏附分子(VCAM-1)、纤维粘连蛋白(FN)的表达和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)的分泌量作为药效学指标,观察了PCA的药理作用。在此基础上,考察其与MAPK信号转导通路的关系。用LPS(15μg/ml,30小时)作为诱导因素,建立了HUVEC凋亡模型,通过Heochest 33258染色和Annexin V/PI/FITC定量检测两种方法考察了PCA的凋亡保护作用。在此基础上,考察了介导细胞凋亡的膜受体-caspase-3途径、细胞线粒体途径、细胞DNA损伤途径和caspase非依赖途径等4条主要信号转导途径中的关键分子,观察它们在PCA作用前后的变化,分析与LPS损伤HUVEC以及PCA保护作用有关的途径。以细胞表面ICAM-1的表达为指标,通过ELISA方法筛选了方中丹参素、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、人参皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1等单体对LPS诱导后HUVEC炎症反应的影响,从中筛选出能够抑制内皮细胞炎症反应的有效单体,并采用正交设计的方法筛选出具有最佳抑制效果的单体组合。结果:以基因表达比值≥2.0作为上调标准,≥0且＜0.5作为下调标准,对全基因表达芯片的结果进行分析,结果发现:PCA(0.5mmol/L)可以使TNF-α导致的内皮细胞基因表达变化(如炎症相关基因、黏附分子、血管张力基因表达上调,抗氧化基因下调等)情况得到一定程度的逆转。RT-PCR实验验证了芯片结果的可靠性。PCA(0.25-1.0 mmol/L)能够抑制LPS损伤情况下HUVEC表面ICAM-1、VCAM-1及FN的高表达和炎性介质MCP-1的分泌。这种作用呈剂量依赖性趋势,并且与MAPK-NF-κB通路的活化有关。Heochest 33258染色和Annexin V/PI/FITC定量检测实验发现,LPS刺激后细胞核发生了典型的凋亡样改变,而PCA对此有不同程度的改善;PCA使LPS引起的凋亡细胞数量有所降低,且呈现出剂量依赖关系。进一步对4条主要信号转导通路进行检测的结果表明:LPS诱导的内皮细胞凋亡过程和PCA的保护作用与死亡受体-caspase-3途径有关,而细胞线粒体途径、细胞DNA损伤途径以及caspase非依赖途径则可能没有参与LPS诱导的血管内皮细胞凋亡过程。方中其它单体的筛选结果表明:PCA(0.25-1.0mmol/L)、丹参酮ⅡA(0.11-1.0μmol/L)、人参皂苷Rb1(0.33-3.0μmol/L)、三七皂苷R1(5.0-45.0μmol/L)可以抑制LPS引起的ICAM-1的高表达。运用正交设计方法,对这4种有效单体成分进行组合和药效筛选;结果发现各因素对实验结果的影响顺序为PCA＞Tan＞Rb1＞R1,抑制ICAM-1表达的最佳组合为PCA(1.0mmol/L)+Tan(0.33μmol/L)+Rb1(3.0μmol/L)+R1(45.0μmol/L)。结论:通过实验发现复方丹参方中活性单体及其组合可以通过抑制炎性反应和细胞凋亡实验对血管内皮细胞的保护作用,为研究该方内组分对血管内皮细胞的作用靶点提供了更为深入的资料,有助于揭示复方丹参方治疗动脉粥样硬化的物质基础和作用途径,以及该方同血瘀证间“方一证”关系;在中药复方作用机制的阐释方面作出了有益的尝试,说明从现代生命科学的角度解释中药复方的作用机制是可行的。