论文部分内容阅读
目的:研究柴胡疏肝散对大鼠胃Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)自噬的影响及其机制,进一步探讨柴胡疏肝散促胃肠动力的作用机制。方法:依据血清药理学通法制备SD大鼠柴胡疏肝散含药血清,大鼠胃ICC经荧光鉴定,取生长对数期内的ICC与含药血清及相关药物共孵。(1)通过CCK-8法检测高、中、低浓度(高/中/低浓度分别为10mmol/L、5mmol/L、 2.5mmol/L)谷氨酸干预24h对ICC的抑制作用;western blot检测高/中/低浓度谷氨酸、不同作用时间(3h、6h、24h)内ICC自噬蛋白LC3表达的变化;使用透射电镜观察谷氨酸对ICC超微结构、自噬体的影响;免疫荧光法检测谷氨酸对自噬蛋白LC3荧光表达的变化。(2)依据实验(1)获得的谷氨酸最适作用浓度及最适作用时间,再设置空白组、10%柴胡疏肝散组、3-MA组(5mmol/L);通过CCK-8法检测各组对ICC活性的影响;使用透射电镜观察各组ICC超微结构及自噬泡的改变;免疫荧光法检测各组ICC自噬蛋白LC3的荧光强度;western blot检测各组ICC自噬信号通路相关蛋白LC3、PI3KC3、Beclin1、Bcl2的表达。结果:(1)与空白组比较,谷氨酸各浓度组对ICC均有显著的抑制作用(均P<0.01)。谷氨酸各浓度组内比较中,中、高浓度组抑制效果强于低浓度组(均P<0.05)。与空白组比较,谷氨酸中、高浓度组在各时间点(3h、6h、24h)其LC3Ⅱ/Ⅰ的比值均显著升高(均P<0.01),其中又以中浓度谷氨酸作用3h后其LC3II/I比值最大(均P<0.01);中浓度谷氨酸干预ICC 3h, ICC内自噬体/自噬泡明显增加,细胞质内空泡增多,平均每个ICC内LC3荧光强度均显著增强(P<0.01)。(2)与空白组比较,谷氨酸组对ICC的活性有显著的抑制作用(P<0.01);柴胡疏肝散组、3-MA组二者与谷氨酸组比较,均可显著提高ICC的生长活性(均P<0.01)。在透射电镜下,空白组可见ICC内有较丰富的线粒体、内质网等细胞器。谷氨酸组可见明显的自噬体,细胞质内空泡增多,而柴胡疏肝散组及3-MA组的自噬泡则不明显。与空白组比较,谷氨酸组平均每个ICC内其自噬蛋白LC3荧光表达显著增强(P<0.01),3-MA组亦存在显著性差异(P<0.05);与谷氨酸组比较,柴胡疏肝散组及3-MA组LC3荧光表达均显著降低(均P<0.01)。与空白组比较,谷氨酸组LC3II/I.Beclin1、PI3KC3的表达均显著升高(均P<0.01),Bcl2的表达则显著降低(P<0.01);柴胡疏肝散组、3-MA组LC3II/I.Beclin1的表达均有显著性差异(均P<0.05),3-MA组PI3KC3的表达低于空白组(P<0.05)。与谷氨酸组比较,柴胡疏肝散组、3-MA组LC3II/I、Beclin1、 PI3KC3的表达均显著降低(均P<0.01),而Bcl2的表达则均高于谷氨酸组(均P<0.01)。与3-MA组比较,柴胡疏肝散组PI3KC3的表达有显著性差异(P<0.05)。结论:柴胡疏肝散对谷氨酸诱导体外大鼠胃ICC的自噬具有抑制作用,提高ICC的生长活性,其机制与非依赖性mTOR自噬信号通路受到抑制有关。这可能是柴胡疏肝散促胃动力的作用机制之一。