【摘 要】
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玉米赤霉烯酮又称F-2毒素（Zearalenone,ZEN）,是一种非甾体雌激素类霉菌毒素,主要由镰刀菌属在其次级代谢过程中产生,具有与雌二醇相似的酚二羟基内酯结构,可竞争性的与机体内雌激素受体结合,从而对人和动物体产生一系列生殖毒性。ZEN广泛存在于发霉的玉米、小麦等谷物及其副产物中,是世界范围内污染最广泛的一种镰刀菌毒素,对人类造成了巨大的安全隐患和经济损失。目前可降解ZEN的生物酶主要有:内
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玉米赤霉烯酮又称F-2毒素（Zearalenone,ZEN）,是一种非甾体雌激素类霉菌毒素,主要由镰刀菌属在其次级代谢过程中产生,具有与雌二醇相似的酚二羟基内酯结构,可竞争性的与机体内雌激素受体结合,从而对人和动物体产生一系列生殖毒性。ZEN广泛存在于发霉的玉米、小麦等谷物及其副产物中,是世界范围内污染最广泛的一种镰刀菌毒素,对人类造成了巨大的安全隐患和经济损失。目前可降解ZEN的生物酶主要有:内酯水解酶、漆酶和过氧化物酶。其中内酯水解酶因具有降解机理明确,脱毒彻底,晶体结构被解析等诸多优势而受到广泛关注。本课题首先通过NCBI数据库挖掘到四个可能的ZEN内酯水解酶基因,以p ET-22b（+）为载体构建重组质粒,在E.coli BL21中异源表达,经镍柱纯化得到纯酶。结果仅来自Gliocladium roseum的重组酶ZENG成功表达纯化。SDS-PAGE显示ZENG的单亚基分子量约28.5 k Da,聚集状态为二聚体。重组酶的性质鉴定结果显示:最适p H为7.0,在p H 7.0和p H 8.5缓冲体系中孵育3 h后,残余酶活均保持在90%以上,具有较高的p H稳定性;最适温度为38°C,Tm值为50.82°C,在48°C保温7 min后残余酶活约为20%,具有较差的热稳定性;属于金属离子非依赖型酶,金属离子对其催化活性无激活或促进作用;酶动力学研究表明,Km值为129.03±14.90μmol L-1,Kcat值为0.501 s-1;重组酶的酶活约为315±1.03 U/mg,对底物α-ZOL和α-ZAL的降解活力分别约为其对ZEN降解活力的53%和37%。之后以实验室保存的含有D-丙氨酸消旋酶基因（D-alanine racemase,dal）且不含抗生素抗性基因的p UB110为表达载体,构建p UB-p43-Glro-dal重组质粒,实现了该酶在B.subtilis 1A751（dal-）中的食品级表达。选择SR培养基进行摇瓶发酵产酶,发酵过程无需添加诱导剂,随发酵时间延长,重组菌的OD600值及发酵酶活均呈现先升高慢慢趋于平稳再下降的整体变化趋势。其中,重组菌的OD600值在14 h达到最高约5.8,发酵酶活在16 h达到最高约5.2 U/m L。这提高了目的酶的应用安全性。最后采用分子生物学手段并结合计算模拟和理性设计引入突变点,提高重组酶对底物α-ZOL的降解活力及其热稳定性。突变体V153H酶对底物α-ZOL的降解活力提升为野生酶的1.46倍,这可能归因于突变点与α-ZOL间形成了氢键;突变体H134L/S136L酶在53°C保温2 min后,残余酶活约为野生酶的1.39倍,热稳定性提高可能是由于疏水残基的引入改变了α螺旋与Loop环连接转角处的疏水微环境;突变体S162P酶在50°C保温2 min后,残余酶活约为野生酶的1.52倍,在48°C的半衰期是野生酶的的3.6倍,Tm值提高了1.74°C,分子动力学模拟和结构分析显示:突变点附近氨基酸残基自由度降低,整体刚性提升,结构更加紧实。
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