研究背景卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤,复发是导致卵巢癌5年生存率无法提高的主要原因。近年来的研究对肿瘤是相同性质的恶性细胞“克隆群”的传统概念提出质疑。肿瘤异质性(Tumor heterogeneity)主要是指在肿瘤的发展过程中,肿瘤细胞不断发生变异,肿瘤从单克隆状态逐渐转变成多克隆状态,不同的肿瘤细胞亚群,呈现出形态、抗原表达、生物学行为以及遗传基因等方面的差异。肿瘤异质性的出现使得肿瘤的个体化治疗成为了必须。Polycomb家族蛋白(PcG蛋白)具有维持细胞自我更新的能力,同时还参与了肿瘤的发生发展,与肿瘤的增殖、转移、复发和治疗抵抗有着密切的关系。PcG蛋白有可能成为卵巢癌肿瘤异质性的分子标记物。研究目的1.明确PcG蛋白能否成为卵巢浆液性乳头状囊腺癌在复发过程中肿瘤异质性的分子标记物。2.了解PcG蛋白的表达是否卵巢浆液性乳头状囊腺癌患者的预后相关。3.明确PcG蛋白的表达异质性是否会导致上皮性卵巢癌细胞出现功能异质性。4.探索PcG蛋白出现表达异质性的相关机制,寻找复发性卵巢癌的治疗靶点。研究方法1.制作卵巢浆液性乳头状囊腺癌原发病灶／腹腔播散病灶／淋巴结转移病灶／复发病灶的组织芯片,并建立相应的临床资料信息库。利用免疫组织化学染色的方法,检测PcG蛋白在卵巢癌复发过程中的不同病灶的表达情况,筛选出在不同病灶表达有差异的PcG蛋白。分析差异性表达的PcG蛋白和卵巢浆液性乳头状囊腺癌临床病理特征的相关性,及其对复发和整体生存时间的影响。2.通过Real Time PCR和Western Blot检测上皮性卵巢癌细胞系中PcG蛋白的表达情况,确定PcG蛋白高表达和低表达的细胞模型。MTT法和流式细胞术检测PcG蛋白的表达对卵巢癌细胞增殖能力和生长周期的影响。划痕修复实验和Transwell小室实验检测PcG蛋白的表达对卵巢癌细胞迁移和侵袭能力的影响。MTT法检测PcG蛋白的表达对卵巢癌细胞对化疗药物顺铂和紫杉醇敏感性的影响。平板克隆形成实验检测PcG蛋白的表达对卵巢癌细胞独立生存能力的影响。3.利用荧光原位杂交技术,检测卵巢浆液性乳头状囊腺癌原发病灶和复发病灶中PcG核心基因BMI1和EZH2基因扩增情况。利用miRNA芯片,比较卵巢浆液性乳头状囊腺癌原发病灶和复发病灶miRNA表达谱差异,筛选出差异性表达的miRNAs分子,并进行靶基因预测分析。研究结果1.PcG蛋白的表达在卵巢浆液性乳头状囊腺癌播散、转移和复发过程中呈现动态上升的趋势,可以作为卵巢癌肿瘤异质性的分子标记物。PcG蛋白中,EZH2在淋巴结转移灶、BMIl在淋巴结转移灶、RING1在腹腔播散灶和CBX2在腹腔播散灶的蛋白高表达可以作为卵巢浆液性乳头状囊腺癌患者复发时间的独立预测因子；EZH2在淋巴结转移灶、BMI1在复发灶和PHF1在复发灶的蛋白高表达可以作为卵巢浆液性乳头状囊腺癌患者整体生存时间的独立预测因子。2.PcG蛋白高表达的上皮性卵巢癌细胞在增殖能力、迁移能力、侵袭能力、对化疗药物的抵抗力和独立生存能力五个方面都强于PcG蛋白低表达细胞。3.对于BMI1和EZH2基因,分别有13对和16对样本在复发病灶的杂交荧光信号明显多于原发病灶,且相应样本的免疫组化结果提示蛋白高表达。8个1niRNAs分子(hsa-miR-514b-5p, hsa-miR-4261, hsa-miR-298, hsa-miR-3147, hsa-miR-149*, hsa-miR-3621, hsa-miR-3676, hsa-miR-425*)在卵巢浆液性乳头状囊腺癌原发病灶和复发病灶的表达有显著性差异。miR-298和miR-4261可能通过转录因子ILF3和ZNF207调节PcG核心基因EZH2的表达。结论1.PcG蛋白可以作为卵巢浆液性乳头状囊腺癌在复发过程中肿瘤异质性的分子标记物。2.部分PcG蛋白的表达可以作为卵巢浆液性乳头状囊腺癌患者复发和整体生存时间的独立预测因子。3.PcG蛋白的表达异质性导致上皮性卵巢癌细胞出现功能异质性。4.PcG蛋白的表达异质性,可能是基因拷贝数变化和miRNA调控共同作用的结果。5.PcG基因以及niR-298和miR-4261可能成为复发性卵巢癌治疗的靶点。