目的:砷是一种已知的环境毒物和人类致癌物,长期砷暴露可导致肺癌、皮肤癌、肝癌、膀胱癌、肾癌和前列腺癌的发生风险升高或死亡率升高。由于种属差异,砷致癌的动物模型始终未能完善建立。流行病学证据显示,生命早期无机砷暴露可导致生命晚期癌症的高发和死亡率升高,但机制尚不清楚。CNC-bZIP家族的成员转录因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是调控抗氧化防御体系的重要上游转录因子,在癌症中具有防癌和促癌的双重作用。目前Nrf2在生命早期无机砷暴露导致晚期癌症易感性升高的作用机制尚属空白,因此本研究旨在探讨生命早期环境相关剂量无机砷暴露在增强生命晚期肝癌易感性的过程中,Nrf2的变化特征与作用,为砷的致癌机制研究提供基础资料。据此,本研究第一部分应用野生型C57BL/6小鼠建立生命早期饮水型砷暴露-二乙基亚硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)致肝癌的小鼠模型,探讨生命早期无机砷暴露-DEN处理对小鼠晚期肝癌易感性的影响,同时探讨Nrf2在生命早期环境相关剂量无机砷暴露在增强生命晚期肝癌易感性的过程中的变化。本研究第二部分应用C57BL/6遗传背景的Nrf2基因敲除(Nrf2-KO)和野生型(Nrf2-WT)小鼠,建立生命早期饮水型砷暴露-DEN致肝癌的小鼠模型,探讨Nrf2在生命早期环境相关剂量无机砷暴露在增强生命晚期肝癌易感性的过程中的作用与机制。DEN致癌效应依赖于典型的细胞色素P450家族成员2E1(Cytochrome P450 2E1,CYP2E1)介导的代谢活化作用。因此我们推测,Nrf2可能在以CYP2E1为代表的P450s所介导的毒物代谢中发挥作用。据此,我们在此部分研究中建立了化学物硫代乙酰胺(Thioacetamide,TAA)导致的肝损伤肝纤维化模型,进一步探讨Nrf2在CYP2E1介导的化学物致肝脏损伤效用中的潜在作用。此外,近年来表观遗传学(如DNA甲基化、microRNA表达和组蛋白修饰)改变被认为可能与人类生命早期无机砷暴露导致远期癌症易感性效应密切相关。大量科研证据表明microRNA在Nrf2-Keap1抗氧化通路中发挥重要作用,据此本研究第三部分利用野生型C57BL/6小鼠和原代肝细胞体内外结合的实验方法,探讨生命早期无机砷暴露对Nrf2介导的适应性抗氧化具有关键调控作用的miRNA改变。综上所述,本研究旨在探讨生命早期环境相关剂量无机砷暴露在增强生命晚期肝癌易感性的过程中Nrf2的变化特征与作用,以及microRNA对Nrf2的调控作用,为砷暴露增强癌症易感性的机制提供理论基础。研究方法:1.分别以野生型C57BL/6小鼠、C57BL/6遗传背景的Nrf2-KO和Nrf2-WT小鼠为研究对象,建立生命早期饮水型砷暴露-DEN致肝癌模型。将C57BL/6小鼠随机分为对照组(双蒸水),砷暴露组(饮用水砷浓度分别为0.5 ppm、5 ppm),小鼠均自由摄食饮水。Nrf2基因全身敲除小鼠模型以Nrf2基因敲除杂合子(Nrf2-HET)小鼠作为亲代,分组原则和砷暴露方式同C57BL/6小鼠,收集子代Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠为研究对象。非肿瘤造模组雄性仔鼠断乳后(4周龄)正常摄食,饮用双蒸水,监测仔鼠(4周和8周龄)基础生理指标(体重、脏器系数、体脂成分和血糖),肝脏氧化应激状态。肿瘤造模组雄性仔鼠出生两周时,将对照组和各砷暴露组小鼠随机分为空白组(Vehicle,Veh)和DEN组。DEN组仔鼠给予腹腔一次性注射DEN(25mg/kg体重),Veh组仔鼠腹腔注射相同体积生理盐水,各组仔鼠离乳后正常饲养观察至40周龄,评价肝脏肿瘤形成情况。2.收集4周龄生命早期0.5 ppm无机砷暴露组和对照组小鼠肝脏,利用高通量miRNA基因芯片分析两组间miRNAs表达谱差异,采用靶基因预测软件结合文献筛选出与Nrf2-3’-UTR相互作用的miRNAs。提取原代肝细胞,用瞬时转染miRNA类似物和抑制物的方法上调或下调miRNA的表达,并设置对照组和转染组,检测原代肝细胞中Nrf2及其下游基因的表达。3.采用C57BL/6遗传背景的Nrf2基因敲除(Nrf2-KO)和野生型(Nrf2-WT)小鼠建立TAA诱导肝损伤肝纤维化模型。将8-12周龄雄性Nrf2-KO和Nrf2-WT小鼠按体重随机分为对照组(腹腔注射生理盐水)和TAA组(腹腔注射TAA)。急性实验:TAA剂量为50 mg/kg体重,观察小鼠反应,记录60 h生存曲线;TAA剂量为30 mg/kg体重,分析肝损伤,亚急性实验:TAA 50,100,200和300 mg/kg体重递增给药,每周三次,持续5周,检测小鼠肝功能指标,TAA代谢物水平,肝脏损伤与纤维化相关基因mRNA表达水平和蛋白表达水平。原代肝细胞TAA(20μM)处理后观察CYP2E1蛋白表达水平。结果:1.生命早期无机砷暴露对仔鼠体重、血糖和脏器系数的影响。生命早期无机砷暴露对4周龄断乳期雄性仔鼠体重、血糖和脏器系数均无显著统计学差异(P>0.05)。生命早期砷暴露导致8周龄雄性仔鼠体重升高(P<0.05),但对脏器系数和血糖无显著统计学差异(P>0.05)。2.生命早期无机砷暴露加重DEN所致小鼠生命晚期肝脏肿瘤。对40周龄仔鼠进行肿瘤负荷评价,单独DEN处理可诱导小鼠肝肿瘤的发生;与单独DEN处理组相比,生命早期砷暴露联合DEN处理组40周龄仔鼠肝脏肿瘤发生率无显著变化(P>0.05),但肿瘤体积大,且肝脏肿瘤负荷、肿瘤指数与生命早期砷暴露水平存在剂量效应关系(P<0.05)。免疫组化染色结果显示,生命早期砷暴露联合DEN处理组(DEN+0.5 ppm As和DEN+5ppm As)小鼠肝脏中PCNA阳性细胞数高于DEN单独处理组。3.DEN处理小鼠肝脏肿瘤中存在Nrf2高活性。与对照组小鼠肝组织相比,DEN处理小鼠肝脏肿瘤组织细胞质中NRF2蛋白水平无明显变化,但肿瘤组织中NRF2核内富集显著增加(P<0.05)。此外,Nrf2及其下游基因(Gs、Homx1和Nqo1)的mRNA水平在肝脏肿瘤组织中显著升高(P<0.05)。4.Nrf2活化存在于人肝癌组织且可能与肝癌不良预后有关。对人肝癌组织进行基因表达谱分析发现,NRF2在人肝癌组织中表达高于正常肝脏组织。对肝癌患者进行生存分析发现,NRF2高表达肝癌患者的整体生存率低于NRF2低表达的肝癌患者,NRF2在肝癌组织中高表达可能与肝癌预后不良有关(P=0.09)。通过矩阵图比较NRF2下游基因在人肝癌组织中的表达情况发现,与正常肝脏组织相比,NRF2下游基因(GSS、GSR、SQSTM1、GCLM、GCLC、HMOX1和NQO1)表达水平在肝脏肿瘤组织中均有升高趋势,且NRF2与其下游基因在肝癌组织中均呈现良好的相关性。5.生命早期无机砷暴露诱导4周龄仔鼠肝脏Nrf2活化。生命早期无机砷暴露后,与对照组相比,生命早期砷暴露4周龄仔鼠全血还原型谷胱甘肽(GSH)和总谷胱甘肽(GSH+GSSG)以及还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)出现升高趋势,并且生命早期5 ppm砷暴露组GSH、(GSH+GSSG)以及GSH/GSSG比值与对照组相比升高,差异具有统计学意义(P<0.05);不同剂量(0.5 ppm和5 ppm)砷暴露组,仔鼠肝脏Nrf2的mRNA和蛋白水平均高于对照组(P<0.05),且5 ppm砷暴露组小鼠肝脏Nrf2下游基因Gs、Gr和Hmox1的mRNA水平高于对照组(P<0.05);生命早期砷暴露组小鼠肝脏中GS、GR、p62、GCLC和GCLM的蛋白水平均高于对照组(P<0.05)。6.Nrf2-全身基因敲除小鼠模型确认。qPCR和Western blot检测生命早期无机砷暴露小鼠肝脏中Nrf2及其下游基因(Gr,Gs,p62,Nqo1,Gclc和Hmox1)的表达发现,与4周龄Nrf2-WT小鼠相比,生命早期无机砷暴露Nrf2-KO小鼠肝脏中Nrf2,Gr,Gs,p62和Nqo1 mRNA表达水平在砷暴露组(5 ppm)显著降低,差异有统计学意义(P<0.05),且上述基因蛋白表达水平在砷暴露组(0.5 ppm)均显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。7.Nrf2缺失减弱生命早期无机砷暴露和DEN所致肝脏肿瘤形成。对40周龄小鼠肿瘤形成情况分析发现,DEN单独处理组、DEN+0.5 ppm砷暴露组和DEN+5 ppm砷暴露组Nrf2-KO小鼠肝脏肿瘤发生率均低于Nrf2-WT小鼠。与DEN单独处理组相比,DEN+0.5 ppm砷暴露组和DEN+5 ppm砷暴露组肿瘤指数和肿瘤负荷呈升高趋势,且DEN+5 ppm砷暴露组与DEN单独处理组间差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,DEN+0.5 ppm砷暴露组和DEN+5 ppm砷暴露组Nrf2-KO小鼠肝肿瘤指数和肿瘤负荷与Nrf2-WT小鼠相比呈降低趋势,且肿瘤指数在DEN+5 ppm砷暴露组Nrf2-KO与Nrf2-WT小鼠间差异有统计学意义(P<0.05),肿瘤负荷在DEN+0.5 ppm砷暴露组和DEN+5 ppm砷暴露组Nrf2-KO与Nrf2-WT小鼠间差异均有统计学意义(P<0.05)。8.生命早期无机砷暴露对P450s具有潜在影响。根据mRNA-seq结果,对差异表达基因进行KEGG通路富集分析发现,花生四烯酸代谢、P450s介导的外来化学物代谢和化学物致癌通路均发生了显著变化。9.Nrf2缺失通过促进CYP2E1蛋白降解,抑制TAA代谢活化及其所致小鼠肝脏损伤效应。HE染色和天狼星红染色结果表明,与Nrf2-WT小鼠相比,TAA处理后Nrf2-KO小鼠肝脏纤维化减弱,且Nrf2-KO小鼠肝脏组织中COL1α1蛋白水平低于Nrf2-WT小鼠(P<0.05)。50 mg/kg TAA处理60 h后,Nrf2-WT小鼠存活率为57%,而Nrf2-KO小鼠存活率为86%。30 mg/kg TAA处理后,Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠血浆ALT和AST水平显著升高(P<0.05);且48 h时Nrf2-KO小鼠血浆ALT水平显著低于Nrf2-WT小鼠(P<0.05);HE染色显示,Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠均出现急性肝损伤。TAA处理24 h后Nrf2-KO小鼠尿液中TAASOx/(TAA+TAASOx)的比值显著低于Nrf2-WT小鼠(P<0.05),且Nrf2-KO小鼠肝脏中AcK蛋白水平显著低于Nrf2-WT小鼠(P<0.05)。进一步提取小鼠原代肝细胞发现,TAA处理后,Nrf2-WT和Nrf2-KO小鼠原代肝细胞中CYP2E1蛋白半衰期分别为29.4 h和22.6 h。10.生命早期无机砷暴露对仔鼠肝脏microRNA的影响。生命早期无机砷暴露引起4周龄仔鼠肝脏microRNA(miRNA)谱显著变化。筛选出显著变化的miRNA,应用靶基因预测软件预测对Nrf2具有调控作用的miRNA,并结合文献梳理直接调控Nrf2表达的目标miRNA,验证上述筛选所得目标miRNA的表达及其对Nrf2表达和活性的影响结果发现,miR-126-3p、miR-677-3p、miR-7664-3p、miR-3087-5p、miR-144-3p和miR-27-3p在生命早期0.5 ppm砷暴露条件下显著降低(P<0.05)。11.miR-144-3p对原代肝细胞中Nrf2表达与活性具有调控作用。根据miRNA表达丰度(CT=24-28)和保守性,筛选出4个miRNA进行下一步功能验证。体外功能学验证发现,将miR-144-3p类似物(50 nM,48 h)转染入原代肝细胞后发现,Nrf2的mRNA和蛋白水平均显著降低(P<0.05)。将miR-144-3p抑制物(100 nM,48 h)转染入原代小鼠肝细胞中,NRF2的蛋白水平显著升高(P<0.05),且Nrf2及其下游基因(Gs、Gr、p62、Gclc、Gclm、Nqo1和Hmox1)表达水平均显著升高(P<0.05)。12.miR-3087-5p对Nrf2表达具有潜在作用。进一步体外实验进行miR-7664-3p、miR-27-3p和miR-3087-5p的功能学验证,将miR-7664-3p、miR-3087-5p和miR-27-3p抑制剂(100 nM,48 h)分别转染入原代小鼠肝细胞中,结果发现,miR-7664-3p和miR-27-3p抑制剂不影响原代肝细胞中Nrf2表达,miR-3087-5p抑制剂处理后Nrf2的mRNA水平无显著变化(P>0.05),但NRF2蛋白表达水平显著升高(P<0.05),miR-3087-5p抑制剂使Nrf2下游基因Gr和Gclm的mRNA水平降低(P<0.05)。结论:1.生命早期环境水平砷暴露诱导Nrf2活化,增强DEN诱导的仔鼠肝癌易感性。2.Nrf2介导的适应性抗氧化参与砷暴露所致小鼠肝癌易感性增强,Nrf2敲除显著抑制生命早期环境水平砷暴露诱导的肝癌易感性增强效应。3.Nrf2敲除可抑制CYP2E1蛋白稳定性,进而降低通过CYP2E1介导代谢活化的化学物所致肝损伤效应。4.生命早期砷暴露可通过miRNA影响Nrf2的表达与活性。miR-144-3p对原代肝细胞中Nrf2表达与活性具有调控作用,miR-3087-5p对原代肝细胞中Nrf2表达与活性具有潜在作用。