眼附属器是边缘带黏膜相关淋巴组织淋巴瘤较为多发的一个结外部位,在眼眶实体肿瘤中占10%~15%。可发生在眼眶、结膜、泪腺、眼睑。黏膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤中结外边缘带淋巴瘤(EMZL)的一种特殊类型。绝大多数患者起病隐匿,临床经过缓慢,有着惰性的发病过程。由于缺乏特征性的免疫表型和分子遗传学标记,目前对MALT淋巴瘤的诊断仍然主要依靠临床和组织病理学特征。淋巴瘤的组织学分型繁杂且为一个动态发展的病变过程,临床症状缺乏特异性,易与炎性假瘤、淋巴组织反应性增生等炎症疾病相混淆,在病程的把握和类型的判断上难以区分,病程迁延反复,病理学镜下形态对一些交界性不典型病变难以归类,从而直接影响治疗效果和患者的预后。患者在反复发病的过程中长期给予激素治疗,效果不确定局部疼痛剧烈且引起全身各系统并发症,严重者终末期发展到全身Ⅳ期淋巴瘤而死亡。MALT淋巴瘤的发病机制至今尚未明了,欧美人种以弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)多见。目前国外学者从分子遗传学和分子生物学角度研究其发病机制,发现其与免疫学和遗传学两方面因素密切相关,越来越多的证据表明Bcl10基因参与了NF-kappaB信号通路激活,该通路引起肿瘤细胞的凋亡抑制在MALT淋巴瘤发病机制中可能起重要作用。本实验研究通过检测中国人群眼眶、结膜、泪腺、眼睑部位的MALT淋巴瘤、不典型淋巴组织增生和淋巴组织反应性增生中Bcl10基因的存在,对照国外文献报道,从中发现新的突变。观察突变型Bcl10基因蛋白表达及与激活NF-kappaB通路之间的关系,探讨Bcl10基因新的突变和突变型Bcl10基因在MALT淋巴瘤诊断方面的意义,为明确Bcl10基因激活NF-kappaB信号通路在MALT淋巴瘤发病机制中的作用提供新的依据。一、目的1.检测Bcl10基因在眼眶、结膜、泪腺、眼睑部位的MALT淋巴瘤、不典型淋巴组织增生、淋巴组织反应性增生中的表达,探讨其在临床诊断中的意义。2.观察突变型Bcl10基因和NF-kappaB在MALT淋巴瘤、不典型淋巴组织增生、淋巴组织反应性增生中的蛋白表达和核定位,考察两者之间的相关性,发现突变型Bcl10蛋白的核表达对NF-kappaB信号通路的影响,推测Bcl10基因的突变所引起核表达导致NF-kappaB核转位在MALT淋巴瘤的发病机制中可能存在的作用。二、方法1.收集上海第二军医大学长征医院眼科2005年~2006年间收治的病理诊断为眼附属器MALT淋巴瘤患者23例,不典型淋巴组织增生患者10例,淋巴组织反应性增生患者10例为阳性组,正常外周淋巴结组织12例为阴性对照组。阳性病例组以2001年WHO淋巴造血组织肿瘤分类为诊断标准,双盲法经两位病理医师筛选纳入研究。其中23例MALT淋巴瘤患者,男性15例,女性8例,平均发病年龄62.31±11.23岁(40岁~82岁)。10例不典型淋巴组织增生患者男性6例,女性4例,66.92±7.5岁(55岁~76岁)。10例淋巴组织反应性增生患者,男性5例,女性5例,71.69±3.65岁(55岁~78岁)。所有病例均采用手术切除新鲜标本。术后取标本立即冻存于液氮中保存备用。2.应用分子生物学方法检测所有研究对象眼附属器MALT淋巴瘤、不典型淋巴组织增生、淋巴组织反应性增生中Bcl10基因的表达,双脱氧Sanger法行DNA测序,进入GENBANK BLAST比对分析,对照国外报道序列,发现新的突变类型。3.应用免疫组织化学(Envision法)和免疫荧光(间接法)检测突变型Bcl10和NF-kappaB在所有研究对象中的蛋白表达。4.应用激光共聚焦显微镜(Leica公司,TCS,SP2型)观察Bcl10和NF-kappaB表达的共定位。第1通道FITC(异硫氰酸荧光素),最大吸收光谱488am,最大发射光谱520nm,为二抗标记鼠抗人Bcl10抗体,为绿色荧光;第2通道Cyanine3,最大吸收光谱543nm,最大发射光谱570nm,二抗标记NF-kappaBp65抗体,为红色荧光。DAPI染核,紫外光发射光谱360nm。5.数据用x±s表示。Bcl10基因的表达率、Bcl10基因的突变率在阳性组和阴性组之间的比较采用χ2检验,Fisher确切概率法检验分析。Bcl10核表达和Bcl10突变率之间的关系、Bcl10核表达和NF-kappaB表达之间的关系,采用χ2检验,Fisher确切概率法检验和spearman等级相关分析。所有结果采用SPSS11.0统计软件包进行分析,以P﹤0.05认为差异有显著性意义。三、结果1.阳性组43例研究对象中,21例(48.84%)检出Bcl10基因的cDNA表达,比较国外报道突变序列,发现有新的突变12例(57.14%)。分别是外显子294位核苷酸缺失129个碱基,导致编码蛋白区由正常全长233位氨基酸截短为99位氨基酸;该突变序列我们已发布于GENBANK (EF189176)。4例出现的同一种突变为:外显子638位核苷酸点突变G→A,导致编码蛋白区第213位氨基酸甘氨酸突变为谷氨酸。外显子308位核苷酸点突变T→C,导致编码蛋白区第103位氨基酸颉氨酸突变为丙氨酸;外显子368位核苷酸点突变T→C,导致编码蛋白区第123位氨基酸谷氨酸突变为甘氨酸;外显子374位核苷酸点突变A→G,导致编码蛋白区第125位氨基酸苯丙氨酸突变为丝氨酸;外显子5位核苷酸点突变T→C,导致编码蛋白区第2位氨基酸谷氨酸突变为甘氨酸。外显子412位核苷酸点突变T→C,导致编码蛋白区第103位氨基酸颉氨酸突变为丙氨酸。1例突变外显子145位核苷酸点突变A→G国外已见报道。10例不典型淋巴组织增生中有4例检出Bcl10基因的cDNA表达,有1例发现外显子346位核苷酸缺失33个碱基,导致编码蛋白区第116位氨基酸到126位氨基酸的改变,是为mRNA的不同剪辑体。此例国外已见报道。10例淋巴组织反应性增生中2例检出Bcl10基因的cDNA表达,1例检出新的突变为外显子638位核苷酸点突变G→A,与MALT淋巴瘤中出现4例同样的突变相同。12例正常外周淋巴结组织未检出Bcl10基因的表达。Bcl10基因的突变率在阳性组和阴性组之间差异有显著性(P﹤0.05)。Bcl10基因的突变率在不同的恶性程度组中差异有显著性(P﹤0.05)。Bcl10基因突变在不同发病部位之间、不同临床分期之间的差异不具有显著性(P﹥0.05)。2.阳性组中23例MALT淋巴瘤中, Bcl10蛋白在20例MALT淋巴瘤石蜡标本中表达(86.96 %),其中胞核和胞浆同时表达13例(65.0%);胞浆表达7例(35.0%),阴性3例(13%)。10例不典型淋巴组织增生中,5例(50%)胞浆弥漫表达Bcl10。10例淋巴组织反应性增生中,1例(10%)胞核和胞浆同时表达Bcl10,3例(30%)胞浆表达Bcl10。阴性组12例正常淋巴结中不表达。Bcl10蛋白的核表达和Bcl10基因突变之间差异有显著性(P﹤0.05),两者之间具有相关性(P﹤0.05)。Bcl10蛋白的核表达在不同的恶性程度组之间差异无显著性(P>0.05)。阳性组23例MALT淋巴瘤中,18例胞核和胞浆同时表达NF-kappaB(78.3%),胞浆表达5例(21.7%)。10例不典型淋巴组织增生中,7例(70%)胞浆弥漫表达NF-kappaB。10例淋巴组织反应性增生中,1例(10%)胞核和胞浆同时表达NF-kappaB,5例(50%)胞浆表达NF-kappaB。阴性组12例正常淋巴结中均在胞浆表达NF-kappaB。NF-kappaB蛋白在眼附属器MALT淋巴瘤、不典型淋巴组织增生、淋巴组织反应性增生中的阳性率表达差异有显著性(P<0.05)。Bcl10蛋白的核表达和NF-kappaB表达的差异有显著性(P﹤0.05),两者之间具有相关性(P﹤0.05)。3.激光共聚焦显微镜断层扫描的信息用SFP选项进行彩色三维重建后,可见用FITC标记的Bcl10蛋白呈现点状或簇状绿色荧光颗粒分布于细胞核和胞质。用Cy3标记的NF-kappaB蛋白呈现弥漫红色荧光广泛分布于胞质。重建图像后,可见黄色荧光为Bcl10和NF-kappaB共定位,其中Bcl10和NF-kappaB共表达有13例。Bcl10和NF-kappaB的共定位表达呈正相关(P<0.05)。四、结论1. Bcl10基因在中国人群眼眶、结膜、泪腺、眼睑部位的MALT淋巴瘤、不典型淋巴组织增生、淋巴组织反应性增生中有新的突变形式,共发现了12例新的突变,国内外未见报道。2例突变与国外报道相同。其中以第213位氨基酸甘氨酸突变为谷氨酸(GGA→GAA)为主要新的突变形式;其次为截断型突变即由Bcl10的CARD结构域至C端截断,是为全长233位氨基酸截断为99位氨基酸。该突变序列我们已发布于GENBANK (EF189176)。2.本研究在不典型淋巴组织增生和淋巴组织反应性增生中发现了新的突变证明Bcl10基因突变的检测灵敏于病理诊断,能在尚没有形态学改变及其他可鉴别指标下,判断出病变阶段和性质的改变,能对患者提供准确和及时的早期诊断,避免误诊和漏诊,为取得满意的疗效提供机会。3.突变型Bcl10基因与肿瘤的恶性程度有关,其蛋白见于核表达,并与NF-kappaB胞核共定位表达呈正相关,此结果与Bcl10核转位激活NF-kappaB转录入核引起细胞凋亡改变的理论是一致的,可作为早期诊断MALT淋巴瘤的灵敏指标。通过对Bcl10基因突变的检测,为明确Bcl10激活NF-kappaB信号通路在MALT淋巴瘤发病机制中的重要作用提供新的依据。