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背景多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是病变位于中枢神经系统(central nervous system,CNS)一种慢性的自身免疫性疾病,病变的主要特征是CNS的炎性病变、髓鞘的脱失,以及轴索的不同程度的损伤。不同患者的发病特点、病变进展速度各不相同。好发于20-40岁之间,女性更为常见。临床主要表现为突发的视力障碍、旋转型眼球震颤,肢体疼痛、麻木无力,共济失调,尿频、便秘、腹泻、多汗,抑郁、易怒,记忆力减退、判断力下降等。反复发作的神经功能障碍显著影响患者的生活质量,长期以后将会给其带来严重的心理负担,持久用药亦给家属带来巨大的经济负担。当前,对于多发性硬化的治疗集中于免疫干预治疗与对症支持治疗两方面。西医临床急性期多采用皮质激素类抗炎、调节免疫,但不能防止复发;缓解期多采用β-干扰素、免疫抑制剂等药物。β-干扰素可减少多发性硬化复发率,改善残疾程度,但在应用过程中常出现流感样综合征,另有报道称干扰素-β制剂可诱发视网膜病变,且价格昂贵。免疫抑制剂亦可减少复发率,延缓疾病进展,但不能控制疾病的致残程度,另外长期应用可产生急性白血病、骨髓抑制等严重的副作用。中医药则依据整体与局部,辨病与辩证相结合,因人而异个体化特征给予中药辨证施治。通过联合中药在一定程度上可以减少免疫抑制剂的剂量,减轻副作用。同时,中药亦能减轻多发性硬化的临床症状,减少复发次数。实验目的通过观察补肾解毒通络方干预实验性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)大鼠体重、神经功能评分的改变,HE染色研究EAE大鼠的大脑、脊髓多个层面的病理变化,测定不同组别大鼠干预后血清中CD4~+T细胞表面CD28、CTLA-4的表达量。探寻补肾解毒通络方在干预急性期多发性硬化可能的作用机理,为中西医结合治疗多发性硬化较单纯西药或中药治疗更有优势提供一定的依据。方法1.动物分组:将80只雌性SD大鼠运用SPSS22.0随机区组法分为空白组、模型组、中药组、西药组、中西药组,各组16只。2.建立EAE大鼠模型:制备抗原:在无菌条件下取豚鼠全脊髓,精确称取重量,将等体积的冰生理盐水与之混合,盛在玻璃匀浆器中反复冰冻(因豚鼠脊髓中富含的有效成分MBP在高温下易失活)、研磨,期间过程不得少于30min,直至将豚鼠全脊髓匀浆(guinea pig spinal cord homogenate,GPSCH)研磨为外观乳白色液体。最后与等体积的完全弗氏佐剂在低温状态下(其中含卡介苗8mg/ml)充分混合,制备稳定油包水型抗原乳剂。采用多部位注射法诱导雌性SD大鼠制作EAE模型。空白组给予大鼠脚垫皮内及背部皮下分别注射0.4ml和0.1ml的生理盐水。自造模当日起,每日详细记录大鼠精神状态、饮食情况、体重变化及神经功能评分。3.给药方法:自免疫第2日起,空白组、模型组每天给予生理盐水1ml灌胃;中药组每天给予补肾解毒通络方药液,按30g/kg药量给予中药灌胃;激素组每天按6.17mg/kg药量给予醋酸泼尼松龙灌胃;中药加激素组每天按30g/kg中药剂量和6.17mg/kg醋酸泼尼松龙灌胃,连续灌胃17天。4.取材、观察病理及测定指标:于免疫第18天,采用腹主动脉取血法收集大鼠周围血3ml,将带有不同荧光染色剂的CD4~+T细胞单克隆抗体、CD28单克隆抗体、CTLA-4单克隆抗体与血液充分混合,清除血液中红细胞,采用全血直标法上流式细胞机测外周血中CD4~+T细胞表面CD28、CTLA-4的表达量;并用冰生理盐水灌注心脏,取大鼠脑组织及腰膨大部位,将40%的甲醛加入适量的蒸馏水,配为4%甲醛溶液,将组织置于其中浸泡固定。切片石蜡包埋组织,切片,HE法染色观察病理改变。结果1.发病率与体重变化:空白组始终未发病,与模型组相比(13/16),中药激素组(7/16)发病率有统计学意义(P<0.05),免疫前各组间大鼠体重相比,差异无意义(P>0.05),接受免疫后大鼠出现不欲饮食,活动受限现象,此后体重呈短暂上升趋势,于发病前再次下降。空白组大鼠体重则呈现上升趋势,模型组及药物组体重呈现先上升,后下降趋势。第18天,模型组、中药组、西药组、中西药组体重均较空白组明显下降(P<0.01);中药组与中西药物组大鼠体重差异无显著意义(P>0.05);西药组与模型组体重差异无显著统计意义(P>0.05)。2.潜伏期与神经功能评分:模型组于免疫后第7天开始陆续发病,中药组于免疫后第8天开始陆续发病,西药组于第7天开始陆续发病,中西药组于第9天陆续开始发病。中药组与中西药组较模型组潜伏期延长(P<0.05),西药组较模型组潜伏期延长,但无显著差异(P>0.05)。神经功能评分:接受免疫第18天后,与模型组相比,中药组、西药组、中西药物组别神经功能评分均降低(P<0.05);中药组、西药组、中西药物组相互之间无显著差异(P>0.05)。3.发病高峰期炎性病灶数:空白组未见明显炎性病灶,与模型组相比,中药组、激素组、中药激素组均显著减少(P<0.01),中药组炎性病灶数多于激素组、中药激素组(P<0.05),激素组与中药激素组无显著差异(P>0.05)。4.发病高峰期外周血CD4~+T细胞表面CD28、CTLA-4表达量:模型组较正常组CD28明显上升(P<0.01),与模型组相比,中药组、西药组、中药西药组CD28表达量均降低(P<0.05);中西药物组大鼠与西药组大鼠相比,差异无统计学意义(P>0.05)。CTLA-4:与模型组相比,中药组、西药组、中西药物组CTLA-4表达量均增加(P<0.05),西药组、中西药物组之间无统计学意义(P>0.05)。结论:补肾解毒通络方对雌性SD大鼠EAE模型具有延缓发病潜伏期,减轻神经病损症状的作用,可能是通过抑制外周血CD4~+T细胞上CD28分子的表达,促进CTLA-4分子地表达,来调整EAE大鼠的免疫失常状态,减轻临床症状。