论文部分内容阅读
目的:稀土元素（Rare earth elements,REEs）包括元素周期表中的镧系元素以及与镧系的15个元素性质相近的钪（Sc）和钇（Y）。REEs对大脑及中枢神经系统的毒性早有报道。La是LREE的代表性元素,可在脑中高度蓄积,具有化学活性,是目前研究REEs引起的神经毒作用最常用的代表性物质。研究表明,La可损害血-脑屏障以及神经元和神经突触的超微结构,引起神经细胞钙稳态失调,造成神经递质摄取与释放障碍,诱发谷氨酸受体过度活化,学习记忆相关基因、蛋白表达受抑,神经行为异常等,具有确切的中枢神经系统毒性,但相关机制尚未完全阐明。自噬是细胞自我修复和生存的一种进化保守的机制,在真核生物中广泛存在。凋亡是一种细胞自主有序的死亡过程,又称为Ⅰ型程序性细胞死亡,在生物进化、维持内环境稳定以及多个系统器官的发育中发挥重要作用。在生理状态下,适度的自噬和凋亡对于机体有益,但在病理条件下,自噬和凋亡的过度或不足均能造成相关组织器官的损害和功能的异常。细胞凋亡和自噬之间的相互作用对细胞命运至关重要,二者之间既可相互依存又可相互转化。Beclin1是在哺乳动物中发现的第一个调节细胞自噬的基因,通过与Ⅲ型PI3K/VPS34结合形成复合物,在细胞质中募集其他自噬调节蛋白以形成蛋白复合物并促进自噬体膜的形成。Bcl-2家族是细胞凋亡的关键调节因子。研究发现,Beclin-1与抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl结构中均含有BH3结构域,故Bcl-2或Bcl-xl均可通过该结构域与Beclin-1结合形成二聚体,从而阻止后者与Ⅲ型PI3K/VPS34结合,抑制自噬。caspase-3和caspase-6是重要的凋亡效应蛋白,而Beclin1是其底物之一。caspase-3/6裂解Beclin 1可产生Beclin1-N和Beclin1-C两个主要片段,Beclin1-C可定位至线粒体并导致细胞凋亡因子如Cyto c的释放,促进凋亡的发生。此外,促凋亡的单BH3蛋白,包括BAD、BID、BNIP3、NOXA、PUMA等可通过竞争性结合Bcl-2/Bcl-xl,一方面使Beclin 1与Bcl-2/Bcl-xl解聚而发挥促进自噬的作用,同时又从Bcl-2或Bcl-xl中取代并释放促凋亡蛋白BAX/BAK,从而诱导凋亡的发生。神经元作为中枢神经系统的功能单位,在学习记忆的执行中发挥重要作用。神经元属于有丝分裂后的特殊分化细胞,不能像其它细胞那样可以通过分裂增殖来稀释其内部的多余或有害物质,故自稳机制对于其正常结构和功能的维持尤为重要。本研究使用体外实验的方法,观察氯化镧对原代培养的大鼠皮质神经元Bcl-2、Bcl-xl、Beclin1、caspase 3、caspase 6、BAD、BID、NOXA、PUMA、BNIP3的mRNA转录及蛋白表达水平的影响,分析Beclin1-C以及线粒体和胞浆中Cyto c的蛋白表达变化,并使用流式细胞术测定神经元的凋亡率,使用透射电镜观察神经元超微结构的变化,以明确氯化镧对于神经元凋亡、自噬的影响并探讨二者之间的相互关系,为深入揭示镧的神经毒作用机制提供新的实验室资料。研究方法:由中国医科大学实验动物中心提供的成年Wistar大鼠若干只,体重290±10g,雌性大鼠和雄性大鼠按照2:1的比例合笼进行交配。雌鼠确认怀孕后单独饲养。于仔鼠出生后24 h内对大脑皮质进行取材,进行原代神经元培养。免疫荧光法鉴定神经元纯度。cck-8法测定细胞存活率并确定染毒浓度及染毒时间。实时定量PCR法测定神经元Bcl-xl、Bcl-2、Beclin1、caspase3、caspase6、BID、BAD、NOXA、PUMA、BNIP3的mRNA转录水平。Western blot法测定神经元Bcl-xl、Bcl-2、Beclin1、caspase3、caspase6、BAD、BID、PUMA、NOXA、BNIP3、Beclin1-C、线粒体和胞浆中Cyto c蛋白表达水平。流式细胞术测定神经元细胞凋亡率。透射电镜观察神经元超微结构。结果:1.培养细胞中NSE阳性细胞率达90%以上,认定培养的细胞为神经元,可用做体外模型进行后续实验。2.随着LaCl3处理浓度的升高,大鼠皮质神经元细胞的存活率显著下降。根据cck-8分析结果,在后续实验中以0.025 mmol/L LaCl3、0.05mmol/L LaCl3、0.1mmol/L LaCl3作为处理浓度,处理时间为24 h。3.LaCl3可上调神经元Beclin1 mRNA及蛋白表达水平;下调Bcl-2、Bcl-xl mRNA转录及蛋白表达水平。4.LaCl3可上调caspase 3、caspase 6 mRNA转录和蛋白表达水平,增加Beclin1-C片段和胞浆Cyto c表达水平,下调线粒体Cyto c表达水平,使神经元凋亡率显著升高。5.LaCl3可上调神经元细胞BAD、BID、BNIP3、PUMA、NOXAmRNA转录及蛋白表达水平。6.LaCl3处理可损害神经元的超微结构,表现为细胞核膜间隙增大,核膜周边染色质浓聚;胞质内出现多个空泡和自噬体;细胞器数量减少,线粒体肿胀、嵴突破坏,呈空泡样改变。结论:1.LaCl3既可引起大鼠皮质神经元凋亡增多,又可促使神经元自噬增强。2.LaCl3通过抑制Bcl-2、Bcl-xl表达,上调caspase 3和caspase 6表达,增加Beclin1-C端片段的产生促使线粒体内Cyto c释放,上调BAD、BID、BNIP3、NOXA、PUMA表达以阻止Bcl-2、Bcl-xl与促调亡蛋白结合等多种机制发挥促神经元凋亡作用。3.LaCl3通过上调Beclin1的表达,增加BAD、BID、BNIP3、NOXA、PUMA与Bcl-2、Bcl-xl的竞争性结合释放Beclin1,以利于该自噬相关蛋白发挥作用,导致神经元自噬增强。4.LaCl3所致的神经元凋亡、自噬机制之间存在密切的关联,自噬相关蛋白Beclin1是其中重要的交汇点,Bcl-2家族中的多个成员参与其中,起到了重要的作用。