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中枢神经系统损伤后功能的重建一直是困扰医学界的世界性难题之一,影响原因比较复杂,除神经元本身的再生能力比较差以外,角质瘢痕的形成,缺乏再生的促进因子,及众多的抑制因子启动的一系列级联反应被认为是影响轴突再生的主要原因。在已确认的髓鞘来源的抑制因子中Nogo-A目前被认为是抑制作用最强的髓磷脂相关蛋白,起着限制轴突再生的关键作用,因而备受关注。Nogo-A是由少突胶质细胞表达的整合膜蛋白,在体内外均有强烈的抑制轴突生长的作用,因此抑制Nogo-A的表达对神经轴突的再生及中枢神经系统损伤后功能的重建将起到一定的作用。血塞通冻干粉是以中药三七的有效药理成分——三七总皂苷(PNS)为主要成分的中药注射剂,具有活血行瘀、通脉活络的功效,广泛应用于临床治疗缺血性的心脑疾病,并取得了很好的疗效。有研究表明,三七的有效成分三七总皂苷能够促进血管内皮细胞增殖及体内新生血管生成,并有抗血小板聚集的作用,从而起到对缺血后脑神经的保护作用。本研究实验是以三七总皂苷(血塞通注射液)为基础,从细胞分子生物学水平探讨中医药对损伤的神经细胞的保护作用,为研究中医药的作用机制提供实验依据。本实验包括五部分第一部分:SH-SY5Y细胞的培养:通过对SH-SY5Y细胞的复苏、培养、传代,为后期实验建立一个稳定的实验平台。第二部分:三七总皂苷(血塞通)对神经细胞SH-SY5Y的无毒范围:通过CCK-8法检测SH-SY5Y细胞的活性,观察SH-SY5Y经不同浓度和时间的三七总皂苷进行处理后SH-SY5Y细胞的增值情况,从而确定安全有效且无毒的实验用药浓度。第三部分:Nogo-A对神经细胞SH-SY5Y细胞的抑制作用:通过CCK-8法检测SH-SY5Y细胞的活性,观察SH-SY5Y经不同浓度和时间的Nogo-A进行处理后SH-SY5Y细胞的增值情况,以确定最佳的抑制浓度用于后续实验。第四部分:三七总皂苷对Nogo-A抑制神经细胞SH-SY5Y细胞生长的拮抗作用:通过CCK-8法检测SH-SY5Y细胞的活性,应用第二、三部分实验结果得出的三七总皂苷及Nogo-A的浓度,测定三七总皂苷大、小浓度在不同时间段对Nogo-A抑制的SH-SY5Y细胞的拮抗作用。并于显微镜下对各组细胞进行观察,比较各组轴突生长情况。第五部分:三七总皂苷对由Nogo-A抑制的神经细胞SH-SY5Y SYN、PSD-95表达的影响:通过免疫组化方法测定突触素(SYN)、突触后致密物(PSD-95)蛋白的表达情况。实验结果1复苏后的SH-SY5Y细胞贴壁良好,细胞轮廓清晰,细胞呈三角形、梭形,多极性等形态生长,突起清晰,胞体边缘光晕明显,胞质折光性强,胞核清晰可见,核仁明显,细胞间可见突起相连。2三七总皂苷溶液作用于神经细胞SH-SY5Y 24、48、72h,无毒范围在1000mg/L以下,浓度在320mg/L,640mg/L时具有较好的促增值的作用,确定为本实验的最佳给药浓度。3 Nogo-A浓度在20×10-3μM时,作用24、48、72h后抑制神经细胞的生长,并与正常对照组比较后有统计学差异,P<0.01。4神经细胞SH-SY5Y在Nogo-A蛋白作用24、48、72h后,活性显著降低,与正常对照组相比较,差异有统计学意义,P<0.01。在加入Nogo-A的同时,加入三七总皂苷大、小剂量,作用24、48、72h,细胞活性升高,且大剂量组活性高于小剂量组,差异有统计学意义。同时,在倒置相差显微镜下观察各组并计算各组的阳性轴突生长百分率,结果与CCK-8保持一致。5免疫细胞化学显示,SH-SY5Y在Nogo-A蛋白抑制后,SYN、PSD-95的表达与正常对照组比较均显著降低,给予三七总皂苷干预后,表达均上升。结论本实验采用SH-SY5Y细胞株,使用Nogo-A造成神经细胞生长的抑制作用,再加入不同浓度的三七总皂苷保护受损的神经细胞,研究表明,三七总皂苷可以拮抗Nogo-A对神经细胞SH-SY5Y的抑制作用,促进其轴突的再生,其作用的机制可能是:上调SYN、PSD-95的表达。