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脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是一种严重致残性疾病,其引起的残疾无论对患者、对家庭或对社会都是一种最严重的灾难,且痛苦和负担往往伴随终身。目前基础及临床研究认为,SCI后神经元的继发性损伤是可能被逆转的,这为SCI治疗提供了可研究方向。小胶质细胞是驻留于中枢神经系统(Central nervous system,CNS)内的免疫细胞,其为CNS的免疫与防御系统的重要组成部分,能够保护CNS免受各种病理因子的侵害,但其有时亦会导致CNS相关病变的进一步恶化。当中风、脑外伤、SCI等神经病变发生后,小胶质细胞在对损伤局部神经元表现出破坏、修复的双重作用。一方面,小胶质细胞可做出迅速的免疫应答,定向迁移至病变部位后释放大量促炎因子启动炎性反应,过度的、反复的炎症反应及有害代谢产物对神经系统造成严重的损害,导致大量神经元的继发性坏死及凋亡,影响神经元的修复、再生;另一方面,小胶质细胞迁移至损伤部位后,其吞噬作用可通过清除凋亡神经元,减少细胞因子、神经毒性物质等释放,进而抑制过度的免疫炎性反应,协调、促进神经元网络状结构的重建及功能的恢复。故而小胶质细胞在CNS生理病理变化中有着重要意义。"脊髓康"是笔者导师临床经验方,临床实践及研究证明该方有着良好的临床疗效。基于此方,我们前期系统开展了多项"脊髓康"干预SCI的基础性研究,结果表明,"脊髓康"对SCI后免疫应答有着重要的调节作用,其能有效促进损伤神经元的修复再生。目前,中医药对小胶质细胞吞噬作用的研究较少,已有研究主要局限于部分中药能够抑制小胶质细胞活化所致的过度免疫炎性反应以降低神经二次损伤的方面,基于此,本研究欲从小胶质细胞吞噬作用角度,探讨"脊髓康"有效干预SCI的潜在机制,为SCI的临床治疗提供一定科学依据。本文第一部分采用慢病毒转染绿色荧光蛋白基因标记小胶质细胞株BV2,核染色标记死亡神经元的方法,建立了一个可动态观察BV2吞噬神经元碎片的体系,研究并证实了"脊髓康"可促进BV2对神经元碎片的吞噬作用;我们认为,中枢神经系统是一个由多种胶质细胞及神经元构成的复杂体系,SCI的发生必然不是单一系统或某一细胞群的病变,而是多因素的"整体病变",故在第一部分的研究基础上,我们提取胎鼠的部分神经组织,未经特殊筛选将其接种于体外环境中培养,初步、简易的模拟了一个多因素、立体式、整体性的混杂细胞体系,在诱导混杂细胞体系中神经元凋亡后予"脊髓康"干预,再次证实了"脊髓康"对模拟的"自然混杂体系"中小胶质细胞吞噬功能的促进作用,体现了中医药"整体"干预的理念;上述两部分实验表明,"脊髓康"能有效调控小胶质细胞的吞噬功能,那么该作用到底是否与促神经修复有相关性?基于这些问题,我们开展了第三部分实验,即验证"脊髓康"是否能通过调控小胶质细胞吞噬作用影响神经元修复再生,在此实验中,我们成功分离、提纯了原代神经元、原代小胶质细胞,建立小胶质细胞/损伤神经元共培养体系,"脊髓康"含药血清间接干预共培养体系,而后以免疫荧光双重标记法观察混培养24h后小胶质细胞对神经元碎片的吞噬作用及96h后损伤神经元突起生长情况,我们发现"脊髓康"促进小胶质细胞清理凋亡神经元碎片的同时,存活神经元的修复再生能力得到了明显的提升。综上,我们得出:中药复方"脊髓康"能够有效促进小胶质细胞吞噬神经元碎片作用,可能以此改善局部微环境,促进损伤神经元的修复再生。第一部分"脊髓康"对小胶质细胞吞噬神经元碎片的影响目的:观察中药复方"脊髓康"对小胶质细胞吞噬神经元碎片的影响。方法:制备"脊髓康"含药血清,分离、培养、鉴定原代神经元,慢病毒转染绿色荧光蛋白基因标记小胶质细胞株BV2,核染色标记神经元,荧光显微镜下观察含药血清干预后小胶质细胞对神经元碎片的吞噬作用。结果:在吞噬百分率方面,"脊髓康"中、高剂量组均高于空白组(P<0.05),与脂多糖组对比差异无统计学意义(P>0.05);在吞噬指数方面,"脊髓康"低、中、高剂量组均高于空白组(P<0.05),中、高剂量组与脂多糖组对比差异无统计学意义(P>0.05)。结论:中药复方"脊髓康"能调控BV2对神经元碎片的吞噬作用,其促进损伤神经元轴突再生的机制可能与此相关。此外,本研究为中医药调控小胶质细胞干预CNS相关疾病的研究提供了新的思路及方法。第二部分"脊髓康"对自然混杂体系中原代小胶质细胞吞噬作用的影响目的:观察中药复方"脊髓康"对自然混杂体系中原代小胶质细胞吞噬神经元碎片的影响。方法:制备"脊髓康"含药血清;分离、培养原代神经细胞,建立混杂细胞体系并予鉴定;以谷氨酸诱导混杂体系中神经元损伤,以"脊髓康"含药血清干预混杂体系;以一抗β3-tubulin、二抗Alexa 594标记神经元骨架及碎片,以一抗CD11b、二抗Alexa 488标记小胶质细胞相关膜蛋白,观察"脊髓康"干预后混杂体系中小胶质细胞对神经元碎片的吞噬作用。结果:在吞噬指数方面,"脊髓康"含药血清低、中、高剂量组均高于空白组(P<0.05),中、高剂量组较LPS组差异无统计学意义(P>0.05);在吞噬百分率方面,中、高剂量组均高于空白组(P<0.05),中剂量组低于LPS组(P<0.05)。结论:抗SCI有效方"脊髓康"可调控小胶质细胞清理神经元碎片的作用,改善局部微环境,促进损伤神经元的修复再生。第三部分"脊髓康"对共培养体系中小胶质细胞吞噬及损伤神经元再生的影响目的:观察中药复方"脊髓康"对共培养体系中小胶质细胞吞噬及损伤神经元修复再生的影响。方法:制备"脊髓康"含药血清,分离、鉴定原代海马神经元、原代小胶质细胞,谷氨酸诱导神经元损伤,含药血清预处理小胶质细胞,建立小胶质细胞/损伤神经元共培养体系,采用免疫荧光双重标记法观察混培养24h后小胶质细胞对神经元碎片的吞噬作用及96h后损伤神经元突起生长情况。结果:混培养24h后,"脊髓康"含药血清中、高剂量组在吞噬指数及吞噬百分率方面均高于空白组(P<0.05),中剂量组低于LPS组(P<0.05),高剂量组则与LPS组无显著差异(P>0.05)。混培养96h后,"脊髓康"含药血清中、高剂量组一级突起数量多于空白组(P<0.05),与LPS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。"脊髓康"中、高剂量组平均突起较空白组长(P<0.05),与LPS对比,"脊髓康"中剂量组平均神经突起较短(P<0.05),而高剂量组则平均突起较长(P<0.05)。结论:"脊髓康"通过调控小胶质细胞吞噬功能促进损伤神经元的修复与再生,这可能与其促进凋亡物质清理后,于局部微环境建立一个无形的保护屏障有关,但其详细机制仍待进一步研究。综上所述,本研究工作的主要创新之处在于:1首次从调控小胶质细胞吞噬作用的角度对中医药干预SCI进行了研究,为"脊髓康"温肾通督抗SCI作用做出了新的科学阐释。2自行研究、建立了多种能准确、有效以及动态观察小胶质细胞吞噬神经元碎片的方法,验证了"脊髓康"对小胶质细胞吞噬的调控作用,一定程度上明确了该作用与神经修复再生的相互关系。3基于中医药干预"整体"理念,及SCI整体病变的思考,体外建立了一个多因素、整体性的混杂体系,并进行了初步的研究。