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目的本研究以鸭圆环病毒（Duck circovirus,DuCV）主要保护性抗原基因Cap为研究对象,分别对DuCV Ⅰ型与Ⅱ型Cap蛋白进行原核表达,比较分析其免疫原性。根据免疫原性比较结果,利用杆状病毒表达系统分别对去核定位信号肽（Nuclear localization signal,NLS）的 DuCV Ⅱ型 Cap 基因和未去 NLS 的 DuCVⅡ型Cap基因进行表达,分析NLS对其表达的影响。在此基础上,将原核表达系统制备重组蛋白rCapⅡ和杆状病毒表达系统制备的重组蛋白rDuCV-CapⅡ分别免疫小鼠,对免疫后小鼠的特异性IgG水平和细胞因子（IL-2、IL-4和IFN-γ）进行检测,评估Cap蛋白的免疫原性,为DuCV疫苗研制储备物质基础。方法分别选取 DuCV Ⅰ 型 DuCV-BJ 毒株（HM162350.1）和 DuCV Ⅱ 型 DuCV-FJ毒株（EF370476.1）Cap基因作为参考序列,通过在线软件件（http://www.ddg-pharmfac.net）和（http://www.iedb.org/）对 Cap 蛋白抗原表位进行分析,并依据大肠杆菌密码子偏嗜性,对编码Cap蛋白的基因进行密码子进行优化、合成、并克隆至原核表达载体pET-28a（+）,构建pET28a-CapⅠ和pET28a-CapⅡ重组质粒。将重组质粒转化至宿主菌BL21（DE3）中进行诱导表达、纯化,获得纯化的重组蛋白rCapⅠ和rCapⅡ。然后,免疫小鼠,对其免疫原性进行比较。在此基础上,选取免疫原性较好的DuCV-CapⅡ基因作为目的基因,利用杆状病毒表达系统中进行表达。同时,为比较NLS序列是否对DuCV-CapⅡ蛋白的表达造成影响,分别构建去除NLS序列的杆状病毒转移质粒pFastBac-DuCV-CapⅠ 和携带 NLS 序列的杆状病毒转移质粒pFastBac-DuCV-CapⅡ-NSL。将转移质粒分别转化至DH10Bac感受态细胞中进行转座,经蓝白斑筛选后获得重组杆粒rDuCV-CapⅡ和rDuCV-CapⅡ-NSL,转染SF9昆虫细胞,连续传代3次,经PCR检测,SDS-PAGE,Western blot,间接免疫荧光,电镜等实验方法鉴定,筛选获得能够表达DuCV-CapⅡ和DuCV-CapⅡ-NSL基因的重组杆状病毒。经SDS-PAGE和Western blot分析比较后,选取Cap表达量相对较高的重组杆状病毒DuCV-CapⅡ-NSL进行大量培养,并采用蔗糖密度离心法进行纯化,获得重组杆状病毒rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL。为评估rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL（杆状表达系统）免疫原性及其不同免疫策略的免疫效果,选取6-8周龄Balb/c小鼠,分为4组,连续免疫3次,每次间隔14天,分别免疫 rCapⅡ 蛋白、rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL 蛋白、rCapⅡ 蛋白+rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL 蛋白（Prime-Boost）,并设 PBS 对照组。在首免后 0d,14 d,28 d,42 d对小鼠尾部进行采血、分离血清,通过ELISA方法检测各组的特异性抗体IgG水平。同时,首免后42d,通过CCK-8法检测各组小鼠的淋巴细胞增值情况,并对免疫小鼠的IL-2,IL-4和IFN-γ等细胞因子进行检测,评价重组蛋白的免疫效果。结果通过生物信息软件分析显示,DuCV-BJ株和DuCV-FJ株Cap蛋白平均抗原指数都大于0.5,具有良好的免疫原性,且抗原表位区域存在差异。人工修饰的DuCV-BJ和DuCV-FJ基因分别在BL21宿主菌中诱导表达后,经SDS-PAGE和Western Blot进行检测,成功获得重组蛋白rCapl和rCapⅡ。将2种rCap蛋白免疫Balb/c小鼠后,均产生了特异性IgG,并刺激机体产生高水平的细胞免疫,初步表明DuCV的Cap蛋白具有良好的免疫原性,且rCap-FJ组IgG水平高于rCap-BJ组,但差异不显著（P＞0.05）,其免疫原性较好。在此基础上,以免疫原性较好的 DuCV-CapⅡ 基因作为研究对象,分别构建重组质粒pFastBac-DuCV-CapⅡ和 pFastBac-DuCV-CapⅡ-NSL,转化至 DH10Bac 感受态细胞中进行转座,经PCR检测,成功获得重组杆粒rDuCV-Cap Ⅱ和rDuCV-CapⅡ-NSL。然后将重组杆粒转染SF9昆虫细胞,经PCR检测,在3065 bp和3170 bp处出现与理论值大小一致的条带。经SDS-PAGE和Western blot检测,在28 kD和32 kD处出现目的条带,且在免疫荧光实验中,均观察到特异性红色荧光,重组杆状病毒rDuCV-CapⅡ和rDuCV-CapⅡ-NSL经透射电镜检测,可观察到重组杆状病毒粒子。表明成功筛选到重组杆状病毒rvAc-DuCV-CapⅡ与rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL,且未去除NSL序列的Cap基因重组杆状病毒表达量更高。小鼠免疫实验结果表明:与PBS对照组比较,三个免疫组IgG抗体水平均呈显著上升趋势;三免后14 d,与PBS组相比,三个免疫组IgG水平差异极显著（P＜0.01）;在三个免疫组中,三免疫后14 d Prime-Boost免疫组IgG水平明显高于 rCapⅡ 免疫组与 rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL 免疫组（P＜0.05）,rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL免疫组IgG水平高于rCapⅡ免疫组（P＜0.05）。淋巴细胞增值实验中,Prime-Boost 免疫组 SI 值最高（1.634±0.181）、rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL 免疫组 SI 值次之（1.626±0.207）,rCapⅡ 免疫组 SI 最低（1.446±0.167）,Prime-Boost 免疫组与 rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL 免疫组 SI值差异不显著（P＞0.05）,与rCapⅡ免疫组差异显著（P＜0.05）,且三个免疫组与PBS组比较差异均极显著（P＜0.01）。细胞因子水平检测结果显示:三个免疫组间小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的分泌水平,差异不显著（P＞0.05）,但明显高于PBS阴性对照组（P＜0.05）。三个免疫组间相比,Prime-Boost免疫组的抗体水平和淋巴细胞增值指数均最高;rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL免疫组的抗体水平和淋巴细胞增值指数高于rCapⅡ免疫组,表明通过原核表达系统和杆状病毒表达系统获得的rCapⅡ蛋白均能够刺激脾细胞增殖,促进机体的体液免疫和细胞免疫,但杆状病毒表达rCap免疫原性强于原核系统表达的rCap,且Prime-Boost免疫策略有效提高了免疫效果。结论1、利用pET-28a原核表达系统,成功实现了 DuCV Ⅰ型和DuCV Ⅱ型Cap基因的高效表达,且通过小鼠免疫实验比较表明,DuCV Ⅱ型Cap蛋白免疫原性较好。2、利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统实现了 DuCV-CapⅡ基因和DuCV-CapⅡ-NSL基因的表达,并成功获得重组杆状病毒rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL与rvAc-DuCV-CapⅡ,且相同条件下,未去除NSL序列的Cap基因在重组杆状病毒中表达量较高。3、利用小鼠免疫实验,对重组杆状病毒rvAc-DuCV-CapⅡ-NSL和重组蛋白rCapⅡ的免疫原性及其不同免疫策略进行比较表明,杆状病毒表达rCap免疫原性强于原核系统表达的rCap,且Prime-Boost免疫策略有效提高了免疫效果。