【摘 要】
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目的神经功能修复是缺血性脑卒中急需攻克的科学难题。脑缺血后神经修复与神经重塑、神经再生和血管生成关系密切。锌作为脑内含量丰富的微量元素,在脑缺血后由受损神经元的突触囊泡释放,对神经元和血管内皮细胞均发挥重要作用。目前,对于锌在脑缺血后的研究主要集中在急性期,在脑缺血修复期的作用尚不明确。脑缺血修复期通过血管新生增加缺血部位血供促进神经功能恢复,星形胶质细胞HIF-1α/VEGF信号通路是血管生成的
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目的神经功能修复是缺血性脑卒中急需攻克的科学难题。脑缺血后神经修复与神经重塑、神经再生和血管生成关系密切。锌作为脑内含量丰富的微量元素,在脑缺血后由受损神经元的突触囊泡释放,对神经元和血管内皮细胞均发挥重要作用。目前,对于锌在脑缺血后的研究主要集中在急性期,在脑缺血修复期的作用尚不明确。脑缺血修复期通过血管新生增加缺血部位血供促进神经功能恢复,星形胶质细胞HIF-1α/VEGF信号通路是血管生成的主要通路,因此,本课题旨在确定锌在脑缺血修复期通过星形胶质细胞HIF-1α/VEGF通路促进神经功能修复。方法本课题选用雄性成年Spregue-Dawley（SD）大鼠制作大脑中动脉闭塞模型（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）,具体实验分组分为:假手术组（Sham）、模型组（MCAO）、锌治疗组（MCAO+Zn）,每种处理方式的大鼠均选取缺血2 h后再灌注14 d、21 d、28 d三个时间点。锌治疗组采取Zn Cl2（10mg/kg）连续腹腔注射,分别从缺血后7 d至14 d、21 d、28 d结束。脑皮质宽度指数实验、粘贴物移除实验、前肢踩空实验以及旷场实验评估锌对缺血大鼠脑损伤的保护作用。应用免疫荧光染色方法检测锌离子在脑内变化,并观察锌与不同类型神经细胞共定位情况。通过细胞增殖标记物（BrdU）检测锌处理后大鼠脑缺血修复期血管新生及神经再生情况。采用Western Blot方法观察锌处理后大鼠脑组织中GFAP、VEGF-A、HIF-1α以及VEGF-R2的蛋白表达水平。在通路验证方面,应用细胞氧-糖剥夺（OGD）刺激模型,给予星形胶质细胞SYP-5（HIF-1α抑制剂）处理,利用MTT法检测细胞活力。Western Blot方法检测星形胶质细胞经SYP-5处理后VEGF-A、HIF-1α蛋白表达水平。实验数据使用SPSS19.0进行统计分析,数据以平均值±标准差（means±SD）表示,P＜0.05视为差异显著。结果在本研究中,采用脑皮质宽度指数,粘贴物移除实验,前肢踩空实验以及旷场实验评估大鼠脑损伤程度。发现在大鼠脑缺血修复期,给予锌治疗可以有效减少脑缺血引起的脑萎缩,同时大鼠的神经功能学评分也较模型组明显改善。以上结果确定了锌能够促进大鼠脑缺血修复期的神经功能修复。随后,本研究对脑梗死周边区的脑组织不同细胞与锌离子探针进行免疫荧光染色,结果发现在脑缺血梗死周边区锌与神经元仅有少量的共定位,大部分锌与星形胶质细胞有明确的共定位,这一结果提示锌可能是通过作用于星形胶质细胞来参与脑缺血修复期的神经修复。因此本研究通过在体BrdU增殖实验进一步验证了锌对脑缺血后星形胶质细胞的增殖情况。结果发现锌处理后GFAP/BrdU阳性细胞数和CD31/BrdU的阳性细胞数都较模型组显著增多,而模型组与给锌组均未检测到Neu N/BrdU阳性细胞。这些结果表明锌能够促进脑缺血后星形胶质细胞活化增殖及修复期的血管新生。为进一步确定锌通过星形胶质细胞促进脑缺血后神经恢复的作用机制,我们首先通过体外实验验证星形胶质细胞HIF-1α/VEGF信号通路。在体内实验中应用免疫荧光染色和western blot法检测通路蛋白的表达水平,结果发现,与MCAO模型组对比,给予锌治疗可以增加星形胶质细胞中HIF-1α、VEGF-A和VEGF-R2的蛋白水平。以上结果表明锌可以促进大鼠脑缺血修复期血管新生,并通过星形胶质细胞HIF-1α/VEGF信号通路起到促进脑缺血损伤后的神经功能恢复的作用。结论综上,本研究的实验数据表明,在大鼠脑缺血修复期给予锌治疗可以减轻因脑缺血引起的脑萎缩,并能够改善大鼠脑缺血修复期的神经功能缺损。同时,本研究阐明了锌在脑缺血修复期神经修复的相关机制,锌通过星形胶质细胞HIF-1α/VEGF信号通路促进血管新生,进而促进神经功能修复。本研究丰富了锌在脑缺血后修复期的神经保护作用,同时也为锌成为缺血性脑血管病的治疗干预靶点提供基础实验的研究证据。
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