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目的 1．NK4因子原核基因工程表达体系的构建 2．NK4因子生物学活性的测定 方法 本研究利用原核基因工程技术体系，构建NK4蛋白因子的pGEX-4T-1-NK4高效原核表达克降。目的基因的获取采用PCR体外扩增的方法，以本室构建的pBV220-hrHGF-α为模板，设计特异性引物获得NK4基因片段。表达载体选择可以在大肠杆菌工程菌BL21中得到高效表达的pGEX-4T-1，这种载体是一种融合表达载体，其序列中在多克隆位点(MCS)上游插入一段谷胱苷肽巯基转移酶(GST)片段。经过化学诱导的方法(TPTG诱导)，得到GST-NK4融合蛋白。其中GST是一种纯化标签，可以在后续的蛋白分离纯化中使用GST亲和层析的办法纯化目的蛋白，这将使纯化工作变得简单而有效。纯化后的融合蛋白可以在体外被凝血酶(thrombin)切割去除，并不影响NK4因子的生物学活性。 采用超声法破碎菌体；用洗涤剂Triton X-100、脱氧胆酸钠等洗涤包涵体；研究在不同的离心转速和不同浓度尿素以及超声配合4mol/L尿素的条件下洗涤包涵体的效果；采用梯度稀释复性法和Sephacryl S-200分子筛层析复性法恢复目的蛋白的生物学活性；用GST亲和层析进一步纯化NK4因子。NK4蛋白因子的生物学活性主要是：1)人肝细胞生长因子(HGF)的完全拮抗剂；2)血管生成抑制作用；3)抗肿瘤转移侵袭作用。尤其是其血管生成抑制剂的功能决定了其在治疗肿瘤等疾病中的重要意义。生物活性的测定主要采用鸡胚绒毛尿囊膜(choriallantotic membrane，CAM)血管生成抑制实验方法。 结果 1．NK4基因重组 1)NK4因子特异引物的设计 上游引物山西医科大学2003届硕士学位论文 5’(;(、G(;Al’CCATGCCAGCACTGAAGATAAAAACC3’ 卜游引物 乃’(;(’(;’川;A(’l’1、A‘l’TAGA(’l’ATI、GTAG(玉1’GTGGT3’ 自行设i}月一委托人连汉‘卜物呀罕有限公司进行引物扩增可行性分析，全，〔i论11卜实‘乡1物可行。 2)模板序列测定 委托人连‘}二‘l物一程有限公司进行HGF一链cDNA序列测定，与GENE BANK对比证实，序列止确。 :3)I〕CRJ广增NKI目的基l习 建’j合适的PCR反应体系，成功获取了NK4基因，测序结果止确。 4)表达载体解以一4丁一l鉴定及线性载体的制备 应川可酶切载体多克隆位点仁的BamHI和Sal刁l限制性内切酶分别进于J几单酶切与双酶切井与DNA标准相比较，证实载体止确。 劝p俄Xl T 1 NKI表达克隆的构建 采用诱泞表达法结合质粒人小直接比较法和PCR快速扩增法筛选出阳性重纠子，井进行了表达，证实获得了融合蛋白GST一NK4因子的高效表达，表达晕一可以，}、到全菌蛋自的55%。 6)W。·、1。，，11弓]()lting鉴定GSI’一NK性 经w。、。。二1一b比tt，昭鉴定，表达蛋自确实为(}ST一NK4。2.入K川);1J’原核表达条件的研究J)两EX一斗‘rl一NKd表达菌株BL21生长特性研究 勺愁川.卫!特性分析 其基l)、1，(.j卜、dsgal(入ts857indl Sam7 nins laeUVS一T7基l月1)，该菌株有物;叮和l〔)。两种蛋自酶缺陷，这有利于日的蛋自的高表达。 ②l)(;「x一11、l一NK4一田21生长曲线不湃究 在阳。C温度时，绘制PGEX一4T一1一NK4一BL21的生长曲线，发现该凶在l小日、{一场分时进入对数生长期。2)pGEX一4T一卜一NK4表达菌株B[.21诱导起始时间的研究 根据菌的牛长曲线，在其生长达到对数生长期中后期，即2小时作为诱针起夕台】付间。:3)P(正X一们’一1一NK4表达菌株BLZI诱导持续时间的研究 分别进行了1、2、3、4、5小时的诱导，发现在诱导2小时后表山西医科大学2003届硕士学位论文达即可达到最人。4)一诱导剂1川，G浓度对pGEx一4T一1~NK4表达菌株BL21表达日的蛋自的影响 分别侧}究J‘0.Olmmol/L、0.Osmmol/L、0.lmmol/L、0.25mmol/L、0.smool八、0.75mmol/1、1.Ommol/L IPTG对表达量的影响，结果发现0.Olmm()l厂l_lP双;即可完全诱导taC启动子的全部启动并表达融合蛋自·5)士言养基p日值对pGEX一们一l一NK4表达菌株BL21表达日的蛋自的影响 分别进行了p卜l为6.0、6.4、7.0、7.3、7.8、8.ILB培养基对表达的影响，发现该菌在中性偏碱的培养基中表达量较高。6)诱导温度对pG厂X一4T一l一NK4表达菌株BL21表达目的蛋自的影响 分别进行了25’C、300C、37℃温度状态卜，以IPTG化学诱导，发现其均可表达，全菌表达量:37℃最高，其次为30℃诱导时。7) pGEx~4T一1一NK4表达菌株BLZI表达目的蛋自表达形式的分析 在25℃、30℃、37℃温度卜，lmmol/L工PTG化学诱导后的菌经超声破菌离心，观察日的蛋自是以包涵体形式表达还是以可溶状态表达，从而确定目的蛋自的表达形式。结果发现:在37℃菌体以包涵体的形式表达，在朋℃菌体1:要以可溶性状态表达，在25“C菌体也以包涵体形式表达。t.J溶表达的量比较为300C>25℃>37℃，包涵体表达量比较为37℃>: 25OC>3()℃。3.GS下一NK4融合蛋自纯化及复性1) GS下NK性包涵体的洗涤①破菌?