【摘 要】
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目的:研究STIM1、Orai1蛋白在原代培养的正常大鼠肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)上的表达和相互作用关系,为肺动脉高压研究提供基础实验依
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目的:研究STIM1、Orai1蛋白在原代培养的正常大鼠肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)上的表达和相互作用关系,为肺动脉高压研究提供基础实验依据。方法:利用PCR技术获得STIM1、Orai1基因,分别与载体p LV-c-flag、p LV-c-HA连接,构建慢病毒载体p LV-c-flag-STIM1、p LV-c-HA-Orai1;将慢病毒载体p LV-c-flag-STIM1、p LV-c-HA-Orai1感染大鼠PASMCs,Western-blot检测感染前后STIM1、Orai1蛋白表达;钙荧光测定大鼠PASMCs,观察钙池操纵性Ca2+内流;利用免疫荧光结合激光共聚焦技术对flag、HA标签蛋白进行共定位,观察经Ca2+释放激动剂(CPA)处理前后STIM1、Orai1蛋白位置变化;分别用STIM1、Orai1抗体进行免疫共沉淀,观察大鼠PASMCs中STIM1、Orai1两种蛋白的相互作用关系。结果:重组载体p LV-c-flag-STIM1、p LV-c-HA-Orai1经双酶切、测序鉴定正确;将慢病毒载体p LV-c-flag-STIM1、p LV-c-HA-Orai1感染原代培养大鼠PASMCs,Western-blot检测STIM1、Orai1蛋白表达量明显增高,具有统计学意义;免疫荧光对标签蛋白flag、HA进行共定位,激光共聚焦显微镜观察到STIM1存在于胞质中,CPA处理前后未出现明显共定位现象;分别以STIM1、Orai1抗体进行免疫共沉淀,Western-blot检测到免疫共沉淀复合物中存在目的蛋白条带,证明STIM1、Orai1蛋白在原代培养的大鼠PASMCs上存在直接相互作用。结论:在原代培养的大鼠PASMCs中,STIM1与Orai1存在直接相互作用。
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