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目的:近年来白色念珠菌（Candida albicans,CA）引起的条件致病性感染日趋严重,随着氟康唑（Fluconazole,FLC）的普遍使用,逐渐增加其耐药性和耐药率,开发利用具有显著抗菌效果、不易产生耐药性的广谱抗菌中药具有解决临床抗感染药物耐药性增强的潜力。在前期研究中,我们发现高浓度（128μg/mL）的中药黄连活性成分盐酸小檗碱（Berberine Hydrochloride,BBH）对白色念珠菌浮游菌和生物膜细菌均有抑制作用,且盐酸小檗碱与氟康唑联用具有协同抑制氟康唑耐药白色念珠菌的作用。故本研究旨在研究药物联用对白色念珠菌耐药株的抑菌作用,通过药物转运蛋白活性、生物膜形成能力、细胞内钙离子稳态等方面来初步探讨药物联用协同抑菌的分子机制,多角度探讨药物联用协同抑菌可能的分子靶标,为临床治疗耐药株感染提供有效的解决方法。方法:1.利用微量稀释法检测盐酸小檗碱以及氟康唑对白色念珠菌的最小抑菌浓度（the Minimum Inhibitory Concentration,MIC）,棋盘稀释法测定联合用药的部分抑菌浓度指数（Fractional Inhibitory Concentration Index,FICI）,筛选具有较强抑制作用的最低药物浓度组合,XXT减低法测定各组药物处理后的动态抗真菌效果,研究药物联用对氟康唑耐药株的抑制作用。2.通过罗丹明6G（Rhodamine 6G,Rh6G）吸收及外排实验来检测药物转运蛋白活性的变化,采用RT-qPCR技术检测其关键基因CDR1、CDR2、MDR1的表达量,研究盐酸小檗碱与氟康唑联用对白色念珠菌药物转运蛋白活性及基因表达量的影响。3.显微镜观察药物联用对菌丝生长能力以及生物膜形成能力的影响,采用RT-qPCR技术检测其关键基因HWP1、ECE1、ALS3的表达量,研究药物联用对白色念珠菌菌丝、生物膜及其关键基因的抑制作用。4.倒置荧光显微镜和流式细胞术观察药物联用对细胞内钙离子稳态的影响,采用RT-qPCR技术检测钙调信号通路相关基因CCH1、MID1、CNB1、YVC1、VCX1、PMC1、PMR1的表达量,研究药物联用对钙流调控及其基因的影响,探讨药物联用协同抑制耐药白色念珠菌可能的分子机制。结果:1.盐酸小檗碱的MIC值为64μg/mL,氟康唑的MIC值≥512μg/mL。5株耐药菌（CA 0253、CA 2119、CA 12038、CA 21065、CA 1460）联合用药的FICI值均<0.5,FICI值最小的浓度组合是2μg/mL的盐酸小檗碱加1μg/mL的氟康唑即后续研究所用的药物处理浓度,联用使氟康唑和盐酸小檗碱的MIC值分别从512μg/mL、64μg/mL降低到1μg/mL、2μg/mL,能够显著增加耐药白色念珠菌对药物的敏感性。联用组在0-48h内动态抑菌效果显著优于两药单用组和阴性对照组（P<0.05）,联用组具有协同抑制氟康唑耐药白色念珠菌的作用。2.联用组和两药单用组均可抑制白色念珠菌细胞内Rh6G的外排作用（P<0.05）,药物处理2h时,联用组上清液荧光强度值分别低于氟康唑、盐酸小檗碱单用组1.43、1.28倍,联用组的抑制效果显著优于两药单用组（P<0.05）。但四组药物均不能促进耐药株对Rh6G的吸收作用。联用组与对照组相比分别降低了CDR1、CDR2基因表达量的3.45、3.85倍,但MDR1的表达量却增高了2.27倍,均有统计学差异（P<0.05）。联用组与氟康唑、盐酸小檗碱单用组比较,CDR1基因表达量分别降低5.24、2.66倍（P<0.05）,MDR1基因分别降低1.68、1.70倍（P<0.05）。3.联用组能够显著抑制菌丝的生长,氟康唑单用组有少量较长芽管形成,盐酸小檗碱单用组与阴性对照组形成大量菌丝。联用组能够阻止生物膜的形成;氟康唑单用组可见大量细胞出芽形成假菌丝,细胞相互黏附、聚集成团块状;盐酸小檗碱单用组和阴性对照组能够形成成熟的生物膜,大量菌丝相互交织成网状,其间有许多酵母菌聚集堆积。联用组与氟康唑组比较,HWP1、ECE1、ALS3基因表达量分别降低了7.26、12.20、3.73倍（P<0.05）。联用组与盐酸小檗碱组比较,HWP1、ECE1、ALS3基因表达量分别降低了54.11、34.20、13.62倍（P<0.05）。氟康唑组与阴性对照组比较,HWP1、ALS3基因表达量无统计学差异,而ECE1基因表达量比阴性对照组高5.68倍（P<0.05）。盐酸小檗碱组与阴性对照组比较HWP1、ECE1、ALS3基因的表达量均升高（P<0.05）。4.盐酸小檗碱与氟康唑联用组、盐酸小檗碱单用组处理后白色念珠菌细胞内可见绿色荧光,细胞质内明显Ca2+内流,但氟康唑单用组与阴性对照组处理后细胞内无可见荧光。流式细胞仪检测结果显示,盐酸小檗碱2μg/mL与氟康唑1μg/mL联用组和盐酸小檗碱单用组细胞内Ca2+浓度均高于氟康唑单用和阴性对照组（P<0.05）,且联用组细胞内Ca2+浓度均高于盐酸小檗碱单用组（P<0.05）,但氟康唑单用组与阴性对照组比较差异无统计学意义。所有药物处理组VCX1、PMR1基因与阴性对照组比较表达量均降低（P<0.05）,且联用组VCX1、PMR1基因比盐酸小檗碱单用组低8.89、1.69倍（P<0.05）,但联用组与氟康唑单用组比较VCX1、PMR1基因表达无统计学差异（P>0.05）。联用组和盐酸小檗碱单用组在药物处理后,YVC1基因显著上调,且联用组比盐酸小檗碱单用组高1.62倍（P<0.05）,而氟康唑单用组比联用组低6.47倍（P<0.05）。联用组与盐酸小檗碱单用组在药物处理后,与阴性对照组比较,PMC1基因下调（P<0.05）,而氟康唑单用组PMC1基因表达量增加,分别是联用组和盐酸小檗碱单用组的5.23、5.15倍（P<0.05）。结论:1.2μg/mL盐酸小檗碱和1μg/mL氟康唑联合使用具有协同抑菌效果,且优于两药单独使用,抗真菌剂联合中药能够起到协同抑菌效果。2.药物联用发挥协同抑菌效果可能的分子机制包括:下调药物转运蛋白基因CDR1、CDR2抑制氟康唑药物的外排过程;下调HWP1、ECE1、ALS3基因抑制生物膜初始黏附聚集功能以及菌丝的生长发育过程,导致生物膜形成能力缺陷;还可以上调YVC1基因促进液泡内Ca2+转移到细胞质内,下调VCX1、PMC1、PMR1基因抑制细胞质内Ca2+向液泡、高尔基体内转移,引起细胞Ca2+内流,破坏白色念珠菌细胞内钙离子稳态。