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反相高效液相色谱法(RP-HPLC)是药物有关物质控制的最重要的方法之一。在建立RP-HPLC方法时,需要对色谱系统的分离能力进行验证。通常可以通过与其具有不同分离原理的其它分析方法,如正相高效液相色谱法、高效薄层色谱法(HPTLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)等建立关联,对RP-HPLC方法的有效性作出评价。本论文通过对3种喹诺酮类抗生素有关物质HPTLC与RP-HPLC方法分离能力的相关性研究,探讨如何利用HPTLC作为互补方法,验证RP-HPLC系统的分离能力。全文内容概括如下:一、以加替沙星及其有关物质为例,建立HPTLC与HPLC相关性分析方法。1、建立加替沙星有关物质HPTLC分析方法基于试验设计的理念,建立和优化了分析加替沙星及其8种有关物质的HPTLC方法。利用均匀设计从22种薄层展开常用溶剂中初筛展开剂系统,再利用中心组合设计对各展开剂组分比例进行优化,确定的最优展开剂为:甲醇:1,2-二氯乙烷:氨水:乙腈(V/V/V/V)=2.8:7.2:0.5:0.5。所建立的HPTLC方法:采用MERK高效硅胶GF254薄层板(10×10cm),用水:甲醇(V/V=20:80)预洗后,于110度活化1h;采用3mm条带状点样,点样10μL;室温展开;采用UV扫描方式检测,检测波长为292 nm。2、HPTLC-MS方法分析加替沙星有关物质利用TLC-MS接口技术建立HPTLC-MS的分析方法,获得了各有关物质的Q1质谱数据;确定各杂质的准分子离子峰,并对其主要质谱峰进行归属。HPTLC-MS方法中质谱条件为:ESI正离子检测模式,加热管温度420℃;喷雾针电压4.5kV,锥孔电压为120V,m/z扫描范围为100～500;洗脱流动相为水:甲醇=50∶50;流速:0.3ml/min。每个样品可在90s内完成分析。3、HPLC-MS方法分析加替沙星有关物质采用HPLC-MS方法分析加替沙星及其8种有关物质,获得了各有关物质的Q1质谱数据;确定各杂质的准分子离子峰,并对其主要质谱峰进行归属。HPLC-MS方法:采用Phenomenex C18 (150×4.6 mm, 5μm)色谱柱;流动相为10 mmol/L醋酸铵溶液(醋酸调PH=4.3):甲醇(V/V)=78∶22;柱温30℃;检测波长为292 nm;流速为0.4mL/min ;进样10μL。质谱条件: ESI正离子检测模式;加热管温度420℃;喷雾针电压4.5kV;锥孔电压为120V, m/z扫描范围为100～500。4、利用MassWorks软件建立HPTLC-MS与HPLC-MS质谱数据的相关性利用MassWorks软件分别对加替沙星及其8种有关物质在HPTLC-MS和HPLC-MS分析中获得的准分子离子峰进行校正,计算校正后同位素峰形曲线的相似度,得出不同方法中同一物质的最小相似度值,作为HPTLC与HPLC相关性分析的阈值(97%),以实现在HPLC与HPTLC系统中对元素组成相同的物质的相互相关。二、通过对洛美沙星和环丙沙星降解产物的分析,进一步验证HPTLC与HPLC相关性分析方法分别建立了分析洛美沙星和环丙沙星诸降解混合溶液的HPTLC-MS和HPLC-MS方法,按上述方法将各杂质的准分子离子峰进行MassWorks校正后,计算峰形校正曲线的相似度,洛美沙星的10个降解杂质在HPTLC和HPLC色谱图中可以逐一得到对应;环丙沙星在HPTLC-MS和HPLC-MS分析中可检测到的3个有关物质在两种色谱系统中也得到了逐一对应。本论文的工作说明,利用HPTLC-MS和HPLC-MS技术,通过MassWorks软件,可以方便地实现HPTLC与HPLC色谱图中诸色谱峰的逐一对应,为利用HPTLC作为互补方法,验证RP-HPLC方法的分离能力提供了解决方案。