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丝状真菌因其拥有强大的蛋白分泌能力而被广泛应用于工业酶的生产。随着基因工程与分子生物学的发展,利用丝状真菌生产重组蛋白越来越受到人们的关注。由于任何单一菌种都不能满足不同工业蛋白质生产的需求,因此更多的丝状真菌加入到蛋白质表达宿主菌的候选名单。粗糙脉孢菌具有良好的蛋白表达和分泌能力,并且拥有良好的遗传学研究基础和基因组数据,是利用分子生物学改造构建纤维素酶生产菌株和生产其他目的蛋白的理想菌种,所以利用粗糙脉孢菌构建蛋白生产系统,在基因工程操作上具有明显优势。目前已经有开发粗糙脉孢菌作为蛋白质表达体系的研究,包括表达生产植物蛋白、疫苗抗体和内切葡聚糖酶等,这些研究表明粗糙脉孢菌是发展新型异源蛋白表达的良好体系,具有较大的潜力。本研究利用粗糙脉孢菌良好的基因组研究资源和全基因组基因敲除突变体库,从载体和宿主改造两方面开展研究,初步建立了纤维二糖诱导的粗糙脉孢菌蛋白质表达系统。本研究以3个β-葡萄糖苷酶缺失的三突变株(3ΔβG)为出发菌株,通过真菌杂交技术进一步缺失了两个纤维二糖水解酶CBH1和CBH2,构建了组氨酸缺陷型六突变缺失菌株LQ-1(Δ3βG::Δ2cbh::Δhis3),该菌株可以利用纤维二糖作为诱导物诱导纤维素酶启动子表达,同时又消除了纤维二糖水解酶蛋白的背景条带,可以作为蛋白表达的宿主菌株。同时,构建了分别含有粗糙脉孢菌自身强启动子(Pcbh-1、Pcbh-2和Ptef-1)的3个新的表达载体,该载体带有融合标签蛋白tev-6xhis-gfp,能够高效方便的筛选阳性转化子,也有利于后续目标蛋白纯化。以纤维素酶GH3-4和CBH-1为例,通过对重组表达菌株纤维二糖诱导发酵,对其发酵上清液进行酶活测定、SDS-PAGE电泳分析和Western检测,结果显示重组蛋白GH3-4-GFP和CBH-1-GFP均成功进行了表达和分泌,分泌水平分别为2.77和2.83 mg/L。Pcbh-1启动子重组蛋白表达水平最高,说明在纤维二糖诱导体系中启动子Pcbh-1的启动效率最高,初步建立了粗糙脉孢菌纤维二糖诱导的蛋白质表达体系。