研究背景及目的：　　尿路感染（urinary tract infection，UTI）是临床的常见疾病之一，主要包括肾盂肾炎、输尿管炎、膀胱炎和尿道炎，其致病原中， 80%都为尿路致病性大肠埃希菌（uropathogenic Escherichia coli，UPEC）。较早研究发现，UPEC菌株先黏附尿道上皮细胞后，再侵入细胞，增殖，形成细胞内菌落（intracellular bacterial communities，IBC），使其逃避抗菌药物和机体免疫系统的攻击，条件适宜时，细菌会破坏细胞后，逸出再黏附其他未感染的细胞，使感染反复发作，而间断反复针对感染进行的抗菌药物治疗极易筛选出高耐药和高致病菌株。　　头孢他啶（ceftazidime，CAZ）是临床上复发性 UTI的常用抗菌药物，在其治疗过程中，由于药物的吸收、分布和代谢过程，药物浓度总会在一定时间内低于抑菌浓度，即亚抑菌浓度（sub-minimalinhibitoryconcentration，sub-MIC）。sub-MIC CAZ不影响细菌的生长但可影响细菌的生物学行为，课题组前期发现，sub-MIC CAZ可以通过luxS调节群体感应系统，抑制细菌生物膜的形成。鉴于luxS可调控大肠埃希菌多种毒力因子，因此推测sub-MIC CAZ有可能影响细菌的致病性，有关这方面的研究尚无报道，论文拟以临床分离UPEC为研究对象，筛选高致病性UPEC，研究sub-MIC CAZ对细菌的黏附能力、运动能力、溶血毒性以及细胞毒性的影响，以期为抗菌药物的临床合理使用提供可靠的理论依据。　　研究方法：　　第一部分 临床分离尿路致病性大肠埃希菌致病性分析及实验菌株筛选　　1.1. 菌株来源及分组　　实验所用的 26 株临床分离 UPEC 收集自第三军医大学第一附属医院 2014 年—2015 年的住院患者临床送检标本。按照诊断标准将其分为两组，其中 F1-F15，共15株为反复性UTI分离菌株，为F组；D1-D11，共11株为急性单纯性尿路感染分离菌株，为D组。反复性尿路感染诊断标准为：本次尿路感染前，有过半年内至少2次尿路感染发作，出现尿频、尿急、尿痛等症状，伴有尿常规白细胞升高，尿培养大肠埃希菌计数＞105 CFU/ml，无发热等全身症状者。急性单纯性尿路感染包括既往无尿路感染发作，具有尿路刺激症状，出现尿常规白细胞升高，尿培养大肠埃希菌菌落计数＞105CFU/ml。　　1.2. 药敏试验　　采用MH琼脂平板倍比稀释法测定菌株的 MIC，试验结果判读参照2016版美国国家临床实验室标准委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）标准。　　1.3. 细菌黏附能力检测　　将过夜培养好的菌株，37℃，24孔板，6 h，缓冲液缓慢地冲洗两次，每孔再加入1ml0.9% NaCl充分吹打至黏附的细菌完全溶解，采用细菌菌落平板计数法测定其在孔板上的黏附情况。　　1.4. 细菌运动能力检测　　将过夜培养好的菌株，用高压灭菌后的牙签挑取单个菌落，然后点至半固定培养基的正中间表面，37℃ 18h，观察其泳动生长环的大小，取最长和最短直径的平均值表示细菌的运动能力。　　1.5. 细菌溶血试验　　用LB培养菌株，37℃，过夜培养，然后倍比稀释呈浓度梯度菌液，与2%兔红细胞悬液反应，37℃孵育，3h后观察。以跳空数表示细菌溶血能力。　　1.6. 细菌细胞毒性试验　　采用 LDH 试剂盒，通过比色法定量 LDH 的活性来检验临床收集的菌株对 5637系膀胱癌细胞毒性的差异。　　1.7. 统计学分析　　采用SPSS 17.0软件进行统计。计量数据均以x±s表示，细菌耐药性差异采用卡方检验；毒力因子差异性比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。　　1.8 实验菌株的确定　　按照致病性能力：黏附能力＞7×107CFU/ml，运动能力＞10mm，last well＞7，毒性>80%，筛选下一步的实验菌株。　　第二部分 亚抑菌浓度头孢他啶对临床UPEC致病性的影响　　2.1.不同sub-MIC CAZ对细菌生长的影响　　将菌株F1在37℃孵育24 h，采用紫外分光光度法，每2 h测定OD600 nm吸光度，绘制其生长曲线。　　2.2. 实验分组及菌株处理　　将第一部分研究确定的实验菌株F1用1/4 MIC CAZ处理，并设空白对照组。处理方式如下：用无菌的液体培养基LB摇菌，37℃，180 rpm，18 h；各取1ml菌液加入新的锥形瓶中，CAZ组加入1ml的药液（终浓度为1/4 MICCAZ），空白对照组加入1 ml的生理盐水，无菌LB均补齐为15ml，37℃，200 rpm，6h。（运动实验采取固体培养基法培养细菌）　　2.3. 体外试验　　2.3.1. 菌株F1的耐药和毒力基因检测　　PCR扩增后，采用琼脂糖凝胶电泳检测细菌的ESBL基因（GES、PER、TEM、OXA、VEB、SHV、 CTX-M）和毒力基因（fimI、luxS、flgA、hlyE、ymgC、ybgD、pgaC、yeaR）以初步了解其致病性的基因背景。　　2.3.2. sub-MIC CAZ对F1黏附性的影响　　采用细菌菌落平板计数法测定sub-MIC CAZ对UPEC在孔板上黏附能力的影响。　　2.3.3. sub-MIC CAZ对F1运动能力的影响　　用灭菌牙签挑取单个菌落，点至半固体培养基的正中间表面，37℃，18 h，观察泳动生长环的大小，取最长和最短直径的平均值表示细菌的运动能力。　　2.3.4. sub-MIC CAZ对F1溶血能力的影响　　倍比稀释呈浓度梯度菌液，与 2%兔红细胞悬液反应，37℃孵育 3 h 后观察sub-MIC CAZ对菌株溶血情况的影响。　　2.3.5. sub-MIC CAZ处理F1对细胞毒性的变化　　采用LDH试剂盒，通过比色法定量LDH的活性来检验1/4MIC CAZ对菌株对5637细胞毒性的影响。　　2.3.6. sub-MIC CAZ处理F1对细胞感染能力的影响　　用细菌菌落平板计数法，考察sub-MIC CAZ对细菌在细胞内 IBC形成的影响，用共聚焦荧光显微镜的方式观察细菌IBC在细胞内的形成情况。　　2.4. 体内试验　　2.4.1. 小鼠急性感染模型的建立　　实验动物采用C57BL/6雌性小鼠，尿路进行插管，1×107CFU/ml 50μl给菌一次，建立急性感染模型，共60只。　　2.4.2. sub-MIC CAZ对F1感染侵袭力的影响　　实验组按时间分为感染后6 h、24 h组，每组再分为CAZ组、对照组和空白组，每组10只小鼠，在相应的时间点取小鼠解剖，膀胱行HE切片制作和组织匀浆细菌菌落计数。　　2.5. 统计学分析　　两样本均数比较采用独立样本t检验，以SPSS 17.0软件进行统计。P＜0.05为差异有统计学意义。　　第三部分 亚抑菌浓度头孢他啶对临床分离UPEC致病性影响机制研究　　3.1. F1全基因转录分析　　将F1用1/4 MIC CAZ处理，并设空白对照组，菌株处理方式同2.2。提取细菌的RNA，对其进行全基因转录组测序和分析，考察毒力因子及其相关基因（fimI、luxS、flgA、hlyE、ymgC、ybgD、pgaC、yeaR）的表达。　　3.2. sub-MIC CAZ对F1毒力因子表达的影响　　采用 Real-time-PCR，设空白对照组，对菌株毒力因子其相关基因（fimI、luxS、flgA、hlyE、ymgC、ybgD、pgaC、yeaR）的表达进行检测。　　3.3. 在小鼠体内sub-MIC CAZ对F1毒力因子表达的影响　　采用C57BL/6系雌性小鼠尿道插管造模。实验分组和处理方式同2.3.2。采集膀胱组织标本，组织匀浆后，trizol提取样本RNA，然后用试剂盒[MICROBEnrich kit (Ambion)]将细菌的 RNA 分离出来，采用 Real-time-PCR 对细菌毒力因子其相关基因（fimI、luxS、flgA、hlyE、ymgC、ybgD、pgaC、yeaR）的表达进行检测。　　主要研究结果：　　第一部分 临床分离尿路致病性大肠埃希菌致病性分析及实验菌株筛选　　实验采用26株临床分离大肠埃希菌，其中15株为反复性尿路感染分离菌株，11株为急性单纯性尿路感染分离菌株，致病性检测结果如下： F 组黏附能力 [（5.15× 107±1.66×107） CFU/ml]较D组[（2.57×107±1.22×107） CFU/ml]（P=0.000）显著升高； F组溶血能力（7.31±0.72）较D组（6.03±0.53）（P=0.000）显著升高； F组对5637 细胞的毒性 [（76.66±15.27）%]较 D 组[（50.94±16.25）%]（P=0.000）显著升高；但其耐药性、运动能力没有显著性区别(P>0.05)。　　按照致病性能力：黏附能力＞7×107CFU/ml，运动能力＞10mm，last well＞7，毒性>80%，筛选出F1高致病性菌株进行实验。　　第二部分 亚抑菌浓度头孢他啶对临床分离UPEC致病性的影响　　2.1.不同sub-MIC CAZ对细菌生长的影响　　1/4 MIC和1/8 MIC CAZ处理后的F1生长曲线与空白组没有差异，说明1/4 MIC和1/8 MIC CAZ不会影响细菌的生长，但1/2 MIC CAZ会抑制细菌的生长。　　2.2. 实验分组及菌株处理　　2.3. 体外实验　　2.3.1. F1菌株的耐药和毒力基因检测　　F1携带ESBL基因TEM和CTX-M，毒力fimI、luxS、flgA、hlyE、ymgC、ybgD、pgaC、yeaR均呈阳性。　　2.3.2. sub-MIC CAZ对F1黏附性的影响　　1/4MIC CAZ处理F1后其黏附性[（3.2×107±5.29×106）CFU/ml]远低于空白对照组[（6.63×107±5.13×106） CFU/ml]（P=0.001），表明sub-MIC CAZ可以抑制UPEC的黏附能力。　　2.3.3. sub-MIC CAZ对F1运动能力的影响　　1/4MIC CAZ处理F1后其运动能力[（1.1±0.1）mm]远低于空白对照组[（9±1） mm]（P=0.000），表明sub-MIC的CAZ可以抑制UPEC的运动能力。　　2.3.4. sub-MIC CAZ对F1溶血能力的影响　　1/4MIC CAZ处理F1后其溶血能力（3.66±0.58）远低于空白对照组（7.33±0.58） （P=0.001），显示F1破坏红细胞的能力明显降低，表明sub-MIC CAZ可以降低UPEC的溶血能力。　　2.3.5. sub-MIC CAZ处理F1对细胞毒性的变化　　1/4MIC CAZ处理F1后细菌对细胞毒性[（40.58±7.23）%]远低于空白对照组[（81.23±5.8）%]（P=0.000），sub-MIC 组的 LDH 释放明显减少，表明 F1 对 5637系细胞的毒性显著降低。　　2.3.6. sub-MIC CAZ处理F1对细胞感染能力的影响　　1/4MIC CAZ处理F1后其对细胞的黏附性[（3.92×105±9.52×104）CFU/ml]远低于空白对照组[（9. 8×105±1.78×105）CFU/ml]（P=0.000）；在荧光共聚焦显微镜下观察加入F1感染细胞后的IBC的数量明显的少于空白组组细菌感染的IBC.　　2.4.体内实验　　切片HE染色结果显示，1/4MIC CAZ处理F1后，小鼠膀胱组织白细胞浸润和上皮细胞脱落情况较空白对照组少，感染程度轻微；组织经匀浆后平板菌落计数，1/4MIC CAZ处理F1后组织内细菌[（3.8×105±8.37×104） CFU/g]远低于空白对照组[（1.06× 106±2.07×105） CFU/g]（P=0.000），表明sub-MIC CAZ可以降低F1对小鼠的感染能力。　　第三部分 亚抑菌浓度头孢他啶对临床分离UPEC致病性影响机制研究　　sub-MIC CAZ组和空白对照组的F1的基因表达存在差异，在本研究测定的毒力相关因子中，黏附相关基因fimI表达上调；黏附相关基因ybgD、运动相关基因flgA、溶血相关基因hlyE、群体感应系统基因luxS和IBC相关基因pgaC、ymgC、yeaR表达均下调。体内外Real-time-PCR实验与RNAseq的结果一致。结果证实，sub-MIC CAZ可降低菌株的运动能力、溶血能力和毒性，但黏附相关基因表达结果和细菌表型观察结果不一致。　　结论：　　1、导致反复性UTI的菌株比急性单纯性UTI的菌株致病性更高。　　2.、sub-MIC CAZ能够抑制UPEC的运动能力、黏附能力，降低其溶血能力、细胞毒性，降低细菌在动物体内的感染能力。　　3、sub-MIC CAZ影响UPEC菌致病性的机制可能是通过抑制luxS系统的表达而实现。