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目的:研究EGFR-TKI获得性耐药的分子机制,探索临床耐药患者可行的治疗方向。构建EGFR-TKI耐药细胞株HCC827-TR,研究该细胞株发生差异改变的基因,筛选可能导致其耐药发生的位点,进而明确FGF2/FGFR信号通路活性改变对于该细胞株耐药的作用并探索其机制。方法:对EGFR敏感突变细胞株HCC827-P进行持续药物培养诱导EGFR-TKI耐药细胞株HCC827-TR,利用MTS法检测Erlotinib对于两株细胞抑制率的影响,采用一代测序、基因芯片技术、RT-PCR和Western Blot的方法对目前已经明确的耐药机制进行筛查。对HCC827-P和HCC827-TR进行高通量二代测序,检测出的全部差异基因进行GO富集和KEGG通路富集,并在COSMIC数据库以及GDSC数据库分别检索全部差异基因,结合前期基因芯片的结果,以及各个基因突变的频率,在SIFT,Poly Phen-2,MutationTaster和CADD对所有差异基因进行有害性预测,最终选取FGF2作为目的基因,采用RT-PCR和Western Blot的方法检测所选取的突变基因及其下游信号通路分子表达量上的差异。应用FGFR高选择性抑制剂AZD4547处理两株细胞,明确其单药抑制率,随后联合Erlotinib双药处理两株细胞,验证其耐药性能变化情况;流式细胞仪分别检测Erlotinib单药和联合AZD4547处理后的两株细胞凋亡水平的变化情况;Western Blot验证AZD4547处理后的两株细胞FRS的蛋白水平是否存在差异,并对耐药细胞株检测其在Erlotinib单药和和联合AZD4547作用下信号通路关键激酶P-ERK和P-AKT的变化情况,最后应用RT-PCR的方法检测该信号通路下游相关基因mRNA水平变化。结果:MTS法显示Erlotinib明显抑制HCC827-P细胞株的增殖,呈现明显的量效关系,其IC50约为0.1μmol/L;Erlotinib对于HCC827-TR细胞株的抑制作用随着浓度的升高也有所增加,但其量效关系不如原代细胞显著,其IC50与原代细胞相比至少升高100倍;一代测序结果表明,HCC827-TR和HCC827-P细胞株均存在典型的EGFR19外显子E746-A750缺失突变,但无T790M突变;基因芯片结果提示HCC827-TR和HCC827-P之间存在1480个差异基因,后续的RT-PCR证实HCC827-TR和HCC827-P二者的MET,EGFR,HER2和PTEN的mRNA表达水平没有统计学差异,Western Blot验证两株细胞的PTEN蛋白表达水平一致,耐药株中不存在PTEN的缺失。NGS检测发现HCC827-TR细胞株中存在581个单核苷酸突变,全部为杂合突变,未发现已知的可以造成EGFR-TKI耐药的点突变;HCC827-TR细胞株中存在38处基因的插入缺失,基因组拷贝数目变异区域为10个,未发现已知可以导致耐药的机制,利用GO富集和KEGG通路富集对全部差异基因进行筛选,根据其突变频率和四大软件预测的有害性评分以及既往文献报道选取FGF2这一基因位点进行后续研究,位于4号染色体的FGF2外显子1区的点突变G101T,导致其合成的氨基酸发生了改变p.G34V,34位的甘氨酸被缬氨酸取代;RT-PCR证实在耐药细胞株中FGF2和其受体FGFR2的mRNA水平与原代细胞相比无统计学差异,Western Blot印证FGF2的蛋白水平与原代细胞相比明显增高,而其受体FGFR2的蛋白水平在两株细胞间表达无明显差异,P-ERK和P-AKT这两个下游信号通路关键位置的蛋白激酶在两株细胞分别接受Erlotinib处理后的表达存在显著性差异。MTS法检测AZD4547与Erlotinib联合处理后两株细胞抑制率均有所增加,但HCC827-TR的抑制率增加更为显著并具有统计学差异;流式细胞仪检测证实HCC827-P的两药联合处理组凋亡指数与Erlotinib单药相比没有统计学差异,而HCC827-TR在两药联合处理组与Erlotinib单药组相比发生了凋亡水平的显著增加;两株细胞在单药AZD4547处理后信号通路关键因子FRS2的蛋白水平存在显著性差异,耐药细胞株中Erlotinib单药组与联合AZD4547双药组相比其P-ERK和P-AKT表达水平存在显著性差异;对于耐药株HCC827-TR应用Erlotinib单药组与联合AZD4547双药组,后者信号通路下游BCL-2表达减低,BAX明显增加,CCND1表达减低,P21变化不显著。结论:成功构建EGFR-TKI耐药细胞株HCC827-TR,在该细胞株中未发现已知的耐药机制,初步确定导致该细胞株耐药的靶向基因为FGF2基因,其分子机制为由于FGF2基因点突变导致的蛋白改变造成FGF2/FGFR信号通路的持续活化,从而诱导产生EGFR-TKI获得性耐药,通过靶向抑制该通路可有效逆转细胞株耐药性。