研究背景腹透(Peritoneal dialysis,PD)是终末期肾病(End stage renal disease,ESRD)患者肾脏替代治疗的主要方式之一,而腹膜功能是影响腹透患者毒素清除和超滤能力的核心因素。国外文献报道腹膜功是技术生存和长期生存的独立影响因素,而国内该领域研究较少,缺乏腹透功能长期演变的队列研究。葡萄糖是最常用的腹透液渗透剂,长期高渗糖刺激促进腹膜纤维化和血管新生,增加腹膜转运能力,进而可能影响患者长期预后;同时不同腹膜转运状态也会决定不同糖浓度腹透液的处方,因此腹膜糖暴露与腹膜功能演变之间的因果关系,及二者对腹透患者长期预后的影响均有待进一步研究。其次腹膜糖暴露增加了潜在血糖波动的风险,血糖波动是非透析糖尿病患者生存及并发症的危险因素,但腹透患者血糖波动的研究很少。巨噬细胞是腹透液中常见的细胞,其中M2亚型在多种疾病模型中有促进纤维化和血管新生作用,但鲜有巨噬细胞分型与腹透患者临床指标和腹膜功能关系的研究。研究目的1.回顾性分析腹透患者糖暴露和腹膜功能的特点及二者对预后影响,观察糖暴露和腹膜功能的关系;2.前瞻性观察腹透患者血糖波动特点及与腹膜功能的关系;3.观察糖暴露对透液间皮细胞转分化和巨噬细胞亚型的影响。研究方法第一部分腹透患者糖暴露与腹膜功能关系初探采用回顾性队列研究的方法,纳入2004年1月1日至2015年6月1日在北京协和医院腹透中心开始接受腹透治疗的成年终末期肾脏病患者,收集基线一般资料、实验室指标和腹透相关指标。一般资料:基线人口学资料、临床粥样硬化性血管疾病等合并症、查尔森合并症指数;实验室指标:2008年6月1日至2017年12月1日全部HbAlc和每月一次的FBG数据、基线血常规、肝肾功能、电解质等生化指标、hsCRP或NLR等炎症指标、ALB、UA、SI等营养及代谢指标。腹透相关指标:患者腹膜平衡试验(peritoneal equilibration test,PET)的原始数据,并计算Cr4h D/P,Glu 4h D/D0,Urea 4h D/P,超滤量(Ultrfiltration,UF),按Garred法计算各物质转运面积系数(mass transfer area coefficient,MTAC)。4.25%腹膜平衡试验额外计算DipNa。透析充分性、腹膜转运状态、标准蛋白分解率、是否发生腹透相关性腹膜炎及其临床特征;腹透处方:患者每月一次的门诊随访日期、处方(透析方式、各浓度腹透液及量、留腹、低钙/高钙、每月中位超滤及尿量),并据此计算年糖暴露量。随访截止至2018年3月31日,以死亡为主要终点,技术失败为次要终点,记录患者的转归及原因。比较男女患者基线临床特征,应用Twardowski标准分别根据 Cr 4h D/P、Glu 4h D/D0、Urea 4h D/P、UF 及综合应用 Cr 4h D/P 和 Glu 4h D/D0评价患者基线腹膜转运特点、分布和随时间变化。观察全体患者年糖暴露量的分布,分析所有患者年糖暴露与同期腹膜功能和未来两年腹膜功能变化的关系,并分析不同糖暴露量和腹膜炎对腹膜功能演变的影响。最后利用Cox比例风险模型分析影响腹透患者总体生存和技术生存的独立危险因素,应用Log-Rank检验和Breslow检验比较特定腹膜功能(Cr4hD/P,UF)组间生存有无差异。第二部分腹透患者血糖波动的特点及与腹膜功能的关系应用 CGMS(Continuous Glucose Monitoring System,连续动态血糖监测)观察腹透患者(n=27)行腹膜平衡实验前后72h血糖变化,并根据年龄、性别和72h平均血糖匹配肾功能正常的糖尿病患者(n=20),收集基础临床信息,比较腹透糖尿病和肾功能正常糖尿病及非糖尿病腹透患者血糖波动的特点,计算相关血糖波动指标(连续72h血糖标准差、血糖>7.8 mmoL/L和>11.1mmol/L时间占72h百分比、血糖>7.8 mmoL/L和>11.1 mmol/L的曲线下面积、平均日内极差、平均血糖波动幅度、日内血糖标准差、日间血糖平均偏差、日间血糖平均绝对差和平均透析换液后血糖增量),并根据监测期间进行的标准腹膜平衡实验,计算标准PET试验葡萄糖腹膜吸收量及患者监测期间的腹膜转运功能,初步分析血糖波动指标与腹膜功能及糖吸收量的关系;第三部分腹透液巨噬细胞分型与间皮细胞转分化选择本中心新腹透患者(置管两周后)和规律透析3个月以上的长期腹透患者(3个月到5年,大于5年)收集过夜腹透液。离心法提取腹透液细胞,利用免疫荧光法鉴定 Ml(CD68+TLR4+或 CD68+CD86+)巨噬细胞、M2a(CD68+CD206+)、M2c(CD 68+CD163+)亚型巨噬细胞和间皮细胞(panCK+;应用流式细胞仪术定、B淋巴细胞(CD3+、CD4+、CD19+),间皮细胞(Lin-1-E-Cadherin+)。通过流式细胞仪分析M2a(CD206+CD14+)和M2c(CD163+CD14+)的比例,和激活巨噬细胞(CD14+CD16+)比例,观察上述细胞比例和年龄、腹透龄、腹膜功能的关系。同时根据免疫荧光检测分泌促纤维化因子TGFβ1和IL-1β的巨噬细胞,并应用免疫印迹法检测原代细胞有无促M2分化的IL-34及间皮细胞转分化标志物Vimentin,Claudin,Fibronectin和E-Cadherin。连续培养腹透液原代细胞,初步观察急性和慢性糖暴露对连续培养间皮细胞形态学及转分化的影响。研究结果第一部分腹透患者糖暴露与腹膜功能关系初探1.本研究共纳入457例ESRD患者,开始腹透时平均年龄58.35±15.97岁,随访时间38(22,61)月,男性患者52.5%。患者年糖暴露量为49.3±18.2 Kg,最高糖暴露量可达141Kg/年,随时间推延,平均年糖暴露量逐年增加,均和第1年有显著性差异。2.以Cr 4h D/P和Glu 4h D/D0综合标准判定,本中心患者基线腹膜功能依次为高平均(HA 51.3%)、高转运(H,19.5%)、低平均(LA,18.8%)和低转运(L,10.4%)。以 4h Cr D/P 与 4h Urea D/P 分类符合较好,但 Twardowski 的 Glu 4h D/D0和UF标准显著低估患者腹膜功能分类。高血糖是Glu 4h D/D0低估患者腹膜功能分类的危险因素,回归模型提示血糖大于等于15.0mmol/L时,Glu4hD/D0低估腹膜功能的概率为65.8%。3.透析3个月患者基线Cr 4h D/P是长期生存的危险因素(HR 6.189,p=0.015,CI 1.415-27.069)。生存时间大于2年的腹透患者,BMI、前两年平均糖暴露量和两年平均Cr 4h D/P转运状态是腹透患者长期技术生存的独立影响因素。4.持续性非卧床腹透患者(CAPD)的腹膜转运功能(高Cr4hD/P,低Glu4hD/D0和低UF)的年平均值和年糖暴露显著正相关。规律腹透大于5年的腹透患者(N=76),6项腹膜功能转运指标都呈现转运功能逐年降低。年糖暴露量可以预测腹透患者未来2年Cr4hD/P变化(p=0.006,Spearman)。规律腹透前2年不同糖暴露组腹膜功能均无显著差异,第5年后,高糖暴露组的腹膜转运功能显著高于低糖暴露组;透析前2年一旦发生腹膜炎,腹膜转运功能增高,并持续到第5,6 年。第二部分腹透患者血糖波动的特点及与腹膜功能的关系1.腹透糖尿病(DMPD)患者血糖波动大于非糖尿病患者,其特点为:晨起为最低值,早餐、午餐形成两个高峰,之后持续上升,并在晚餐后到睡前达到全天最高峰,不同于肾功能正常的糖尿病(DM)患者血糖波动特点。平均血糖(MG)水平相当时,DMPD组患者多项血糖波动指标(SDT、CV%、MODD、LAGE、MAGE)显著低于肾功能正常的DM组患者(p<0.05)。2.腹透患者腹膜功能(4hCrD/P值)与72h平均血糖(r=0.41,p=0.042),及多项血糖波动指标:SD(Spearman,p=0.042)、MIFPE(r=0.39,p=0.044)、MAGE(Spearman,p=0.016)显著正相关;而葡萄糖吸收量和最低血糖平均值(MIN,p=0.032)、MAGE(p=0.032)显著相关。第三部分腹透液巨噬细胞分型与间皮细胞转分化1.腹透患者新留取的腹透液中可以分离出间皮细胞、淋巴细胞(CD4+T细胞、B细胞)和巨噬细胞Ml、M2a及M2c等多种细胞;2.透析龄小于3个月患者M2a型(CD206+/CD14+)巨噬细胞比例显著高于长期透析患者,并与透析龄负相关(p=0.008)。CD163+/CD14+和CD16+/CD14+整体的比例与透析龄均无显著相关,但CD 16+/CD14+患者中,透析龄<3个月的患者所占比例显著高于透析3月-5年或者大于5年的患者(p=0.009);3.随着透析患者年龄增加,淋巴细胞样百分比逐渐下降(p=0.050),而CD16+/CD14+%和 4.25%PET 超滤量显著正相关(p=0.012,)。性别、4hCrD/P、4hGluD/D0、残余尿量等临床指标与细胞类型无关。4.流式细胞数和免疫印迹法观察到腹透龄小于3月的患者腹透液中间皮细胞转分化的标志物(Vimentin和Fibronectin)高表达,而间皮细胞的标志物E-Cadherin消失,并且表达促进M2型转化的IL-34。免疫荧光确认腹透液中存在TGF-β1+和IL-1β+的巨噬细胞,但IL-lβ与间皮细胞株共孵育,并不影响IL-34的表达。小结本实验条件下1.腹透患者年度糖暴露逐年增加,与腹膜转运功能显著相关。前2年平均年糖暴露量、BMI和腹膜转运功能是患者长期技术生存的独立影响因素;2.透析前5年腹膜转运功能呈显著递减趋势,基线腹膜功能(Cr4hD/P)是预测患者死亡的危险因素,而糖暴露可以预测未来2年腹膜功能变化;3.平均血糖相当时,糖尿病腹透患者72小时血糖波动指标显著低于肾功能正常的糖尿病患者;腹透患者腹膜转运功能和多项血糖波动幅度显著正相关;4.腹透患者腹透液中巨噬细胞以M2型为主,其中M2a型随透析时间延长比例降低;透析小于3个月患者间皮细胞已经存在间皮-成纤维细胞转分化现象,并能分泌促使M2分化的IL-34;巨噬细胞可分泌TGF-β1、IL-1β,可能参与腹膜纤维化过程。