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腺相关病毒载体(adeno-associated virus vector，AAV vector)因其无致病性、免疫原性低、能介导外源基因的长期表达以及转导的宿主细胞范围广等特性而受到重视，成为很有应用前景的基因导入系统。通常的AAV载体是以血清型2型(AAV2)为基础的，其应用也最为广泛。近年来，其它血清型的AAV载体包括AAV1～8的研究和应用成为热点，因为它们对机体的某些组织有比AAV2更高的转导效率，而且可以有效的避开体内针对AAV2的中和抗体。其中AAV5由于和其它血清型的同源性相对较低而受到关注。与AAV2相比，AAV5能更高效地转导呼吸道上皮细胞、肌肉、神经元、胶质细胞和视网膜组织。
由于AAV是复制缺陷型病毒，需要腺病毒或单纯疱疹病毒的辅助才可以完成复制周期，因而其包装系统一般需要以下四个元件：含外源基因和ITR的载体质粒、含复制酶基因(rep)和外壳蛋白基因(cap)的辅助质粒、辅助病毒和包装细胞。其中ITR是AAV病毒复制、整合、拯救和包装所必需的元件，是AAV载体中唯一的顺式作用元件(cis acting element)。由于对AAV2 ITR的特性和安全性研究比较多，在构建其它血清型的AAV载体时，往往仍采用AAV2的ITR，而仅仅将AAV2的外壳蛋白(Cap2)基因置换成其它血清型AAV的外壳蛋白基因(cap1、cap3、cap4、cap5、cap6、cap7、cap8)，构建成杂合型的AAV载体AAV2/1、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8，这种包装策略也叫做假型包装策略。
然而，多个研究小组发现，由于AAV5和AAV2的同源性较低，这种假型包装策略用于AAV2/5载体制备时还需要对rep2基因进行改造。另外，国际上常用的三质粒共转染方法制备AAV2/5载体，由于需要大量提取质粒和反复转染细胞而不利于大规模制备。本研究的目的是研制一种具有包装AAV2/5载体功能的全功能辅助病毒，用于AAV2/5载体的高效、快速制备，为AAV2/5应用研究打下基础。
首先，用PCR方法和重组DNA技术获得一个rep2/5cap5杂合基因。将AAV5基因组中的rep基因5’端713bp序列替换为AAV2 rep基因5’端的725bp序列，而得到一个杂合的rep2/5基因，以期这个杂合基因编码得到的Rep蛋白可以识别来自于AAV2的ITR2而支持AAV2/5的假型包装。然后，用三质粒pUC18-rep2/5cap5、pSNAV-EGFP、pHelper共转染HEK-293细胞，所得到的细胞裂解液上清再感染BHK-21细胞，发现有很多BHK-21细胞有绿色荧光蛋白的表达，结果表明所构建的杂合rep2/5cap5基因可以支持AAV2/5的包装。
为了获得携带rep2/5cap5杂合基因的重组单纯疱疹病毒，利用一套包含HSV1全基因组的5个粘性质粒(cos6、cos28、cos14、cos56、cos48)，通过将rep2/5cap5杂合基因插入HSV1基因组的UL2基因(cos6)中，同时将EGFP的表达单位插入UL44基因(cos56)中，经过5个粘粒共转染BHK-21细胞，同源重组获得同时携带rep2/5cap5和EGFP的表达单位的重组HSV1-R2/5C5-EGFP。
用PCR方法和southern杂交方法对重组单纯疱疹病毒HSV1-R2/5C5-EGFP的结构进行鉴定，结果表明杂合基因rep2/5cap5已经插入HSV1-R2/5C5-EGFP的基因组中，荧光显微镜下观察病毒感染的BHK-21细胞，发现细胞呈现绿色，表明插入的EGFP表达单位可以正常表达绿色荧光蛋白。
为了研究HSV1-R2/5C5-EGFP的传代稳定性，对这个辅助病毒进行了的6次连续传代实验，然后对传代病毒的滴度进行检测、对杂合基因rep2/5cap5进行了定量PCR分析，结果表明所得到的HSV1-R2/5C5-EGFP可以稳定传代。
最后对HSV1-R2/5C5-EGFP对AAV2/5载体的包装功能进行了研究。以携带报告基因的AAV载体质粒pSNAV-Luc和pSNAV-LacZ为包装对象，用HSV1-R2/5C5-EGFP感染携带载体质粒pSNAV-Luc和pSNAV-LacZ的BHK-21细胞，得到的细胞裂解液上清再感染BHK-21细胞，然后分别进行Luc和LacZ的表达检测，结果发现BHK-21细胞有明显的Luc或LacZ表达，表明所得到的病毒HSV1-R2/5C5-EGFP可以包装出AAV2/5-Luc和AAV2/5-LacZ，具有了支持AAV2/5载体包装的全部辅助功能。
通过本论文的工作，我们构建了一个杂合的rep2/5基因，并和EGFP表达单位一起插入单纯疱疹病毒基因组，得到了一株命名为HSV1-R2/5C5-EGFP的重组单纯疱疹病毒，这个病毒有预期支持AAV2/5载体包装的全部辅助功能，成为一种简便、高效制备重组AAV2/5病毒的通用性辅助病毒，同时，辅毒所携带的EGFP表达盒可以非常方便辅毒的监测。