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研究背景和目的:结直肠癌是威胁人类健康的常见恶性肿瘤之一。目前中国的结直肠癌(Colon Carcinoma)患者五年生存率为32%。欧美发达国家由于开展结直肠癌的筛查项目,其死亡率呈现下降趋势,而我国在结直肠癌的预防及筛查远远不及发达国家。近年来由于国民的生活水平提高、饮食结构的改善等因素,结直肠癌排位死因顺位从第七位升至第五位。临床上结肠癌患者治疗失败的常见原因为肿瘤细胞血行播散、淋巴结转移、结肠癌的局部复发等。目前认为肿瘤的生长及转移涉及诸多因素,其中包括肿瘤细胞侵袭及迁移、肿瘤细胞的抗凋亡以及肿瘤细胞逃避免疫监视等。有研究表明,三联组氨酸核苷酸结合蛋白2(Histidine triad nucleotide binding protein 2,Hint2)表达量高低能影响肿瘤细胞侵袭及迁移等生物学行为,即其表达对肿瘤细胞的转移有着密切联系。Hint2属于HIT(Histidine triad protein)超家族中Hint家族成员,其超家族蛋白质具有相同基本结构域His-X-His-X-His-X-X。HIT蛋白广泛存在于原核及真核生物中。Hint2蛋白位于线粒体,主要作用于呼吸链,具有线粒体蛋白促凋亡作用。在人体不同器官组织中,Hint2的表达量不尽相同。有研究表明,Hint2主要在肝脏和胰腺中表达,且在肝癌细胞中Hint2 m RNA的表达是下降的,Hint2 m RNA在多种恶性肿瘤中表达均降低,其低表达与患者预后呈负相关。目前关于Hint2表达对结肠癌细胞侵袭及迁移能力的影响暂未见报道。前期我们的预实验结果示,Hint2在结肠癌细胞系SW620中表达相对较低,我们探索上调Hint2的表达后结肠癌细胞侵袭及迁移能力的变化,为进一步阐明Hint2的表达参与结肠癌细胞侵袭及转移能力调控的可能机制提供基础研究。方法:1.培养结肠癌细胞系SW620,传代,取对数生长期细胞进行试验;2.构建过表达Hint2的慢病毒载体p LVX-IRES-Zs Green1,通过菌液PCR鉴定、双酶切鉴定、测序鉴定后,转染至293T细胞,培养传代,感染SW620细胞,获得SW620Hint2+细胞;3.在倒置荧光显微镜下取10个视野,计数绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;4.用Western Blot法检测重组后的SW620Hint2+细胞中Hitnt2蛋白的表达情况,以GAPDH为内参;5.用Transwell侵袭和迁移实验、细胞划痕实验来比较SW620组和SW620Hint2+组细胞侵袭及迁移能力的差别;6.用Spearman相关性分析Hint2表达水平与SW620细胞的侵袭及迁移能力的相关性。结果1.转染鉴定:SW620Hint2+组细胞在倒置荧光显微镜下观察为满视野绿色荧光,10个视野荧光蛋白平均表达率(89.34±3.22)%,而SW620组细胞未见绿色荧光,说明转染成功;2.SW620Hint2+组的细胞Hint2表达:Western Blot检测以SW620组蛋白条带的灰度值作为参照,SW620Hint2+组细胞中Hint2蛋白条带的灰度值为SW620组的3.1倍,证实了SW620Hint2+组的细胞已过表达Hint2;3.Hint2表达与肿瘤细胞的侵袭能力的关系:Transwell侵袭实验中48h后SW620Hint2+组穿透基质胶的细胞数少于SW620组(52.33±5.05 vs 112.83±10.11),差异具有显著性(p(27)0.05)。SW620Hint2+组细胞的侵袭能力减弱与Hint2的表达呈负相关(r=-1.000,p<0.01);4.Hint2表达与肿瘤细胞的迁移能力的关系:Transwell迁移实验中,SW620Hint2+组迁移的细胞数少于SW620组(51.17±11.64 vs111.16±11.64),差异亦具有显著性(p<0.05)。划痕实验中24h后SW620Hint2+组细胞迁移的平均距离短于SW620组(0.37±0.03 vs 0.71±0.04),差异有显著性(p<0.05)。SW620Hint2+组细胞迁移能力均减弱与Hint2的表达呈高度负相关(r=-1.000,p<0.01)。结论Hint2的表达能影响结肠癌细胞侵袭及迁移能力,且高表达Hint2能削弱结肠癌细胞的侵袭及迁移能力,Hint2的表达与结肠癌细胞的侵袭及迁移能力呈负相关,由此说明Hint2表达具有抑瘤作用,但在抑制肿瘤转移中的具体作用尚不清楚。