来自Corallococcus sp菌株EGB的α-淀粉酶AmyM能水解淀粉形成麦芽低聚糖,前期研究已证明AmyM具有应用于食品加工的酶学特性。然而,作为食品酶制剂,AmyM的安全和高效生产问题仍未解决。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有公认的安全性和高效性,是常见的食品酶表达宿主。因此,本研究选用B.subtilis作为表达宿主进行α-淀粉酶AmyM重组表达,希望通过对转录、翻译和宿主等方面的优化实现AmyM的安全、高效生产。所获结果总结如下。1.AmyM在B.subtilis中的染色体整合型表达将目标基因置于多拷贝质粒或整合于染色体是B.subtilis 168中两种表达方式,二者各有利弊。质粒型表达存在质粒不稳定性和抗生素安全问题;整合型表达虽能克服质粒型表达的缺点,但基因剂量较低,往往导致产量较低。本研究先尝试AmyM的整合型表达。为了提高AmyM表达水平,从密码子、启动子、信号肽、核糖体结合位点（RBS）等方面进行优化。首先,密码子优化后AmyM的表达量提高了 25%,得到菌株PDAM1。然后,通过比较3个启动子P3510、Pac、Pgc与5种信号肽SPapre、SPbpr、SPyncm、SPepr、SPnpre的不同组合下AmyM的表达量得到最佳启动子与信号肽组合P3510-SPapre,AmyM的最高淀粉酶酶活达到528 U/mL。接着,通过理性设计对RBS进行改造,得到AmyM产量提高21%的突变株PDGRA3。为了进一步提高翻译效率,对AmyM的N端前10个密码子进行随机同义突变,从4000个突变子中筛选获得AmyM产量提高46%的PDN9突变株。最后,通过易错PCR对AmyM表达盒进行随机突变,从104个突变子中筛选获得产量提高31%的突变株PDYC6,AmyM的最高淀粉酶酶活为1247 U/mL。2.AmyM在B.subtilis中的质粒型表达由于AmyM整合表达的产量未达预期目标,我们又尝试AmyM的质粒型表达。质粒型表达首先要解决质粒稳定性和抗生素安全问题。以质粒pUB110为骨架,我们首先建立了一种借助反向筛选标记pheS和共转化方法实现食品级表达系统构建的方法,并用该方法建立了基于必须基因dal和基于毒素-解毒素蛋白的食品级表达系统。其次,我评估了插入位置对质粒稳定性和AmyM表达量的影响,发现mob区域的改变影响最小。接着,我们试图通过优化5’UTR和改变转录终止子等方式提高AmyM的表达水平,但均未获得理想结果,质粒型的最高淀粉酶酶活为800 U/mL。3.AmyM表达宿主的改造鉴于表达宿主的很多特性对重组蛋白表达影响很大,在整合型表达的基础上,我们尝试在宿主方面进行优化。首先,我们发现生长繁殖能力较强的B.subtilis ATCC6051a比B.subtilis 168更适合AmyM的表达（表达量相差21%）。其次,鉴于胞外蛋白酶是重组蛋白表达的关键限制因素,我们用无痕删除方式同时敲除了菌株ATCC6051a的8个胞外蛋白酶基因,获得胞外蛋白酶缺陷菌株AD8,AmyM在菌株AD8中的最高淀粉酶酶活为1799U/mL。再次,为了研究分泌途径、孢子形成以及表面活性剂对AmyM表达的影响,我们过表达了蛋白分泌相关基因prsA、rasP、secG和grpE-dnaK-dnaJ,敲除了芽孢形成相关基因spollAC和表面活性剂合成相关基因srfAC。结果显示,过表达grpE-dnaK-dnaJ、prsA和secG基因使AmyM表达量分别提高27%、26%、14%,敲除srfAC基因后AmyM表达量提高了 15%。宿主的改造得到的最高淀粉酶酶活为2285 U/mL。综上所述,本研究以B.subtilis为表达宿主,首先通过染色体整合型和质粒型实现了 AmyM的分泌表达,并建立了一种构建食品级表达系统的方法;其次,在整合型表达基础上,进一步通过改造宿主提高AmyM表达量。不足之处是AmyM表达量未达预期目标,下一步可以从表达过程和发酵条件两方面入手优化AmyM表达水平。