目的:在全世界范围内,胃癌发病率占恶性肿瘤总发病率的第4位,而死亡率却排在第3位的常见的恶性肿瘤之一。我国是胃癌大国,东南沿海地区是胃癌的高发地区。所以胃癌是严重影响我国国民健康的重大疾病。由于缺乏特异性症状,临床上很难早期发现,临床Ⅲ期、Ⅳ期患者占大多数。目前胃癌内科治疗手段有限,能进行根治性手术的患者比例小,化疗疗效欠佳,靶向治疗也只有曲妥珠单抗和阿帕替尼取得了肯定的临床疗效,但适用人群有限,还存在着治疗耐药问题。当今肿瘤治疗已进入精准医疗时代,需要找到新的治疗靶点,开发新的治疗药物。ROS1是一种是单体型受体酪氨酸激酶,广泛表达于人体肾、小脑、胃肠等多种组织。目前的研究发现在肺癌、卵巢癌、肉瘤、胆管细胞癌和炎性肌纤维母细胞瘤等组织中以基因重排方式激活,是一种癌基因。近年在非小细胞肺癌的临床研究中找到了针对ROS1基因重排的治疗药物克唑替尼。使这一基因成为恶性肿瘤精准治疗研究的重要靶点。已有国内外学者在胃癌临床组织标本中用FISH方法检测到ROS1基因重排,且确定ROS1基因重排与差的临床表型如低分化、淋巴结转移相关。因此虽然ROS1基因重排在胃癌中检出率不高,但已经开发出确定有效的靶向治疗药物,对ROS1在胃癌中的作用机制仍有必要进一步研究。ROS1基因以基因重排的融合基因方式出现,既往的研究主要集中在ROS1融合基因结构和检测方法及融合基因功能的研究方面,然而各融合基因功能并不完全相同。本研究仅以ROS1基因为研究对象,忽略其融合伙伴,并以胃癌细胞为研究对象,探讨ROS1基因本身对胃癌细胞生物学行为的影响和作用机制。为进一步研究以该基因为靶点的治疗提供基础研究数据。研究方法:首先,应用Western blot方法评估四种人胃癌细胞系BGC-823、MGC-803、SGC-7901、HGC-27癌细胞中ROS1蛋白表达量,选取其中表达量最高的两个细胞系为研究对象。构建ROS1基因干扰RNA质粒及无关序列质粒,其基因片段分别为ROS1 sh RNA:5’-GAGGAGACCTTCTTACTTAT-3’;NCsh RNA:5’-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。经测序鉴定证实质粒构建成功。用构建成功的两种质粒分别转染两种选定的胃癌细胞系,培养24小时后应用含G418的培养基进行筛选培养。2周后得到稳定转染目的基因的胃癌细胞株。分别应用Real-time PCR方法和Western blot方法从mRNA水平和蛋白水平两个方面进行鉴定,明确基因敲减率,敲减率在70%以上时进行后续实验。第二步,应用MTT法测定胃癌细胞生长曲线,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,明确ROS1基因敲减后胃癌细胞生长、增殖及凋亡能力的变化;用划痕愈合实验及Transwell小室实验检测胃癌细胞迁移和侵袭能力,明确ROS1基因敲减后胃癌细胞侵袭转移能力的变化。第三步,应用Western blot方法检测凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3,cleaved PARP,Bax,bcl-2蛋白表达情况,了解ROS1基因抑制细胞凋亡途径。Western blot方法检测细胞粘附蛋白E-cadherin,N-cadherin及细胞骨架相关蛋白Vimentin表达情况,明确ROS1基因是否参与胃癌细胞EMT过程。Western blot方法检测信号传导通路蛋白p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT蛋白表达情况,明确ROS1基因细胞内信号传导路径。Real-time PCR方法检测上皮间质转化相关基因Snail,Slug,Twist表达情况及MMP9基因表达情况,明确ROS1基因是否通过诱导肿瘤细胞形成EMT促进胃癌细胞侵袭转移。第四步,应用TCGA数据库分析ROS1在胃癌组织中的表达与临床病理因素的关系及其对预后的影响及ROS1基因扩增的情况。qRT-PCR检测ROS1在37例胃癌组织及配对正常胃粘膜中的表达,应用免疫组化方法检测126例胃癌组织切片中ROS1表达情况。结果:1、Western blot方法检测显示BGC-823细胞和SGC-7901细胞ROS1蛋白相对表达量较高,被选为进一步研究对象。转染含ROS1干扰RNA质粒和无关序列质粒之后,得到稳定转染两个目的基因的胃癌细胞株并成功体外传代培养。经Real-time PCR方法和Western blot方法从mRNA表达和蛋白表达两个方面进行鉴定,确认两个稳转胃癌细胞株ROS1基因敲减率均达75%以上,证实ROS1基因稳定敲减的胃癌细胞株构建成功。2、MTT实验发现ROS1基因敲减后的BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1分别较各自对照组细胞生长速度减慢,生长率较BGC-823细胞及SGC-7901细胞分别下降了37%和30%(P<0.01)。克隆形成实验显示BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞分别较各自的对照组细胞克隆形成数明显减少,克隆形成率分别为19.5%±1.8%vs 37.33%±2.25%、36.17%±1.76%及16.00%±2.00%vs 33.50%±1.50%、31.17%±2.52%(P<0.01)。流式细胞仪检测细胞周期实验显示与BGC-823细胞和SGC-7901细胞比较,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-shROS1细胞G0/G1期细胞比例增高(55.77%±2.70%vs 61.08%±0.87%;55.33%±0.88%vs 67.43%±0.65%),而S期(20.73%±1.83%vs 12.96%±0.20%;18.98%±074%vs 15.78%±0.27%)和G2期(23.25%±0.61%;24.55%±3.15%vs13.98±0.59)细胞比例明显减少,均有统计学差异(P<0.01)。流式细胞仪检测凋亡发现与BGC-823细胞和SGC-7901细胞比较,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞早期凋亡(2.99%±0.11%vs 15.94%±0.85%;5.78%±0.42%vs16.19%±1.01%)与晚期凋亡(0.42%±0.03%vs 0.42%±0.03%;1.18%±0.09%vs9.13±0.62%)比例明显增高(P<0.01)。Transwell侵袭实验结果显示与BGC-823细胞和SGC-7901细胞比较,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞穿过微孔膜由上室进入下室的细胞数明显减少(21.4±2.07 vs 43.2±4.15;20.60±2.30 vs61.4±5.18),差异显著(P<0.01)。3、进一步应用Western blot方法检测凋亡相关蛋白,发现与BGC-823细胞和SGC-7901细胞比较,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞cleaved-caspase-3,cleaved PARP蛋白相对表达量明显上升,分别为:3.71±0.27,1.58±0.04及1.49±0.03,1.91±0.08;Bax蛋白相对表达量(1.43±0.13,1.52±0.07)明显上升,bcl-2蛋白相对表达量(0.50±0.02,0.34±0.02)明显下降,P值均<0.01。而细胞粘附蛋白和骨架相关蛋白的检测结果显示,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞E-cadherin表达量明显增加(2.14±0.13,2.52±0.04),N-cadherin蛋白(0.48±0.04,0.38±0.02)和Vimentin蛋白(0.52±0.04,0.49±0.07)的相对表达量则明显减少,P值均<0.01。在信号传导通路蛋白方面,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞总PI3K蛋白和总AKT蛋白表达量与BGC-823细胞和SGC-7901细胞无统计学差异(P>0.05);但磷酸化的p-PI3K(0.33±0.04,0.42±0.02)和p-AKT蛋白(0.51±0.01,0.54±0.01)相对表达量明显下降,有统计学差异(P<0.01)。(以上结果均分别以BGC-823细胞和SGC-7901细胞的相应蛋白表达量为“1”计算)。4、用Real-time PCR方法检测胃癌细胞诱导EMT相关基因的结果显示,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞中Twist,Snail,Slug三个基因表达均较BGC-823细胞和SGC-7901细胞明显下降,但不同细胞下降程度不一样。BGC-823-sh ROS1细胞中三个基因相对表达量值分别为:Twist(1.59vs2.36),Snail(0.43 vs 0.76),Slug(1.40vs2.06)。SGC-7901-sh ROS1细胞中三个基因相对表达量值分别为:Twist(0.84vs1.00),Snail(0.84vs1.00),Slug(0.57vs1.00)。以上结果均有统计学差异,P<0.01。5、用Real-time PCR方法检测胃癌细胞转移相关的MMP9基因表达情况结果为BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞中MMP9基因表达量较BGC-823细胞和SGC-7901细胞明显下降,分别为0.97vs 1.29及0.43vs1.00,差异有统计学意义,P<0.01。6、TCGA数据库显示胃癌组织中ROS1 mRNA的表达显著高于癌旁正常组织中的表达(P<0.0001)。ROS1高表达与更高的组织学分级(P=0.014)、更高的T分期、N分期、M分期及TNM分期相关(P均<0.0001)。ROS1高表达预后与其低表达患者比较,预后不良。393例胃癌患者中仅有2例患者检测出ROS1基因扩增。7、qRT-PCR结果显示ROS1在37例胃癌患者中的mRNA表达显著高于其在正常胃粘膜中的表达。8、免疫组化结果显示在126例胃癌组织中仅检测到5例ROS1蛋白高表达,ROS1高表达患者的共同特征为年龄均在60岁以上,均有淋巴结转移,且为Ⅱ期以上的进展期胃癌。结论:1、人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞中存在ROS1基因高表达,ROS1基因被敲除后胃癌细胞增殖、侵袭与转移能力被抑制,细胞凋亡显著增加。2、ROS1基因沉默后,胃癌细胞bcl-2/bax比例失衡,激活caspase-PARP途径,导致细胞凋亡增加。ROS1基因通过调节bcl-2/bax比例,抑制caspase-PARP途径活化,抑制胃癌细胞凋亡,促进其增殖。3、ROS1基因通过激活细胞内Twist,Snail,Slug基因,直接或间接下调胃癌细胞E-cadherin表达,促使胃癌细胞发生EMT,促使胃癌MMP9表达增加,增强其侵袭、迁移能力。4、ROS1基因在胃癌内通过激活PI3K/AKT信号传导通路启动肿瘤增殖信号、抑制细胞凋亡,促进胃癌细胞发生EMT。5、TCGA数据资料显示胃癌组织中ROS1mRNA表达显著高于癌旁正常组织,胃癌组织中ROS1mRNA表达与组织学分级、T分期、N分期、M分期、TNM分期相关,胃癌组织中ROS1mRNA高表达与患者不良预后相关。胃癌患者中ROS1基因扩增较为罕见。与正常胃粘膜组织相比,ROS1mRNA在胃癌组织的表达显著升高。6、免疫组化检测结果显示胃癌组织中ROS1蛋白表达为3.97%。