目的:人Shisa样蛋白1(Shisa like 1,SHISAL1)也称KIAA1644,是2012年裴继民等通过计算生物学和结构域序列相似性在脊椎动物中发现的一个新型蛋白。目前关于SHISAL1的作用,尤其是在肝癌中的作用知之甚少。本课题组旨在制备小鼠抗人SHISAL1多克隆抗体,确定SHISAL1在肝癌细胞SMMC-7721中的亚细胞定位,探讨其对肝癌细胞系SMMC-7721和Hep G2的增殖、迁移和侵袭的影响及其相关机制。方法:(1)SHISAL1重组蛋白的表达与纯化:通过反转录PCR从Hep G2肝癌细胞中克隆人SHISAL1基因,将其插入到p ET-28a中构建p ET28a-SHISAL1原核表达载体,导入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白大量表达,通过Ni-NTA亲和层析柱纯化蛋白。(2)SHISAL1多克隆抗体的制备:利用纯化的蛋白免疫8周龄雌性昆明小白鼠,Western blot法鉴定抗体的特异性。(3)SHISAL1的亚细胞定位:免疫荧光细胞化学染色法观察SHISAL1在SMMC-7721亚细胞中的表达,并用高尔基体荧光探针Golgi-Tracker Red对高尔基复合体进行标记以明确SHISAL1在SMMC-7721亚细胞中的定位。(4)SHISAL1基因的慢病毒表达载体的构建和病毒包装:通过反转录PCR从HepG2肝癌细胞中克隆人SHISAL1基因,将其插入到p LVX-Ac GFP-N1中构建p LVX-Ac GFP-SHISAL1真核表达载体;靶向SHISAL1的短发夹DNA克隆到慢病毒干扰载体p GLV3/H1/GFP+Puro(LV3)。验证成功后,与慢病毒包装质粒混合物共转染人胚肾细胞293T,包装成慢病毒液。(5)SHISAL1基因过表达及敲低稳转肝癌细胞株的构建:用上述病毒液分别感染SMMC-7721和Hep G2细胞株,通过嘌呤霉素筛选出稳定感染细胞系,扩大培养并收集细胞总蛋白,利用q RT-PCR和Western blot进行验证。(6)细胞功能的检测:实时无标记细胞分析技术(real time cellular analysis,RTCA)检测细胞增殖活性;平板克隆形成实验检测肿瘤的克隆形成能力及肿瘤干性;流式细胞术检测细胞周期;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力。(7)Western blot、免疫共沉淀和免疫细胞化学染色检测Wnt受体Frizzled5(FZD5)和相关蛋白的表达及相互作用。结果:(1)成功扩增SHISAL1基因,构建重组原核表达质粒p ET28a-SHISAL1,经诱导获得较高纯度的SHISAL1蛋白。(2)制备了小鼠抗人SHISAL1多克隆抗体。(3)免疫荧光染色结果显示,SHISAL1主要在SMMC-7721细胞的细胞质中表达,Golgi-Tracker Red标记结果表明,SHISAL1主要定位于SMMC-7721细胞的高尔基体上。(4)成功包装和收集慢病毒液并构建SHISAL1过表达及敲低稳转肝癌细胞株。(5)SHISAL1水平升高后,HCC细胞增殖、迁移及侵袭能力减弱,而SHISAL1水平减低后导致相反的趋势。(6)位于高尔基体上的SHISAL1抑制Wnt受体FZD5的成熟和细胞表面定位,导致非经典Wnt途径Fyn-Stat3轴失活。(7)FZD5的过表达部分消除了SHISAL1的缺乏所引起的对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。结论:(1)成功制备小鼠抗人SHISAL1多克隆抗体。(2)SHISAL1在SMMC-7721细胞中表达,且定位于其高尔基体上。(3)SHISAL1抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭等,并通过调节FZD5在肝癌中的表达从而发挥抑癌作用。