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我国是世界上最大的水禽生产国,鸭饲养量占到我国水禽饲养总量的70%以上。蛋鸭养殖是我国重要的产业,每年生产300万吨以上的鸭蛋,为社会提供了诸如咸蛋、咸蛋黄、蛋黄粉、蛋黄油、皮蛋等大量农副产品。日益增长的需求促使现代化养殖模式的推进,当前蛋鸭笼养已然成为趋势。家禽对温度敏感,日益加剧的夏季高温更是对脱离水面的蛋鸭造成严重的热应激,导致繁殖性能下降。研究表明,家禽繁殖性能的下降与激素分泌水平有重要关联。颗粒细胞作为卵巢中雌二醇和孕酮合成分泌的主要细胞,为卵泡发育提供适宜的激素水平。热应激对颗粒细胞的影响是当前众多研究关注的热点。尽管有关热应激对颗粒细胞增殖、分泌、死亡的研究已经比较清楚,但迄今有关热应激导致颗粒细胞线粒体损伤和功能障碍,进而影响细胞功能和存活的机制仍然不清楚。因此深入研究热应激条件下颗粒细胞线粒体变化,对有效防控热应激导致家禽繁殖性能下降十分必要。研究表明,热应激可导致家禽肌细胞线粒体损伤并发生氧化应激。值得注意的是,线粒体自噬是线粒体质量控制中重要的一环,目前对家禽卵泡颗粒细胞线粒体的影响,以及线粒体自噬在细胞存活或损伤中的作用尚不清楚。本研究提出假设,即热应激条件下PINK1介导的线粒体自噬可以缓解急性热应激造成的卵泡颗粒细胞线粒体损伤和诱导的细胞凋亡。为此,本研究从体内和体外两个层面上,验证急性热应激对蛋鸭卵巢线粒体自噬和细胞凋亡的影响,并借助干扰技术,进一步研究抑制线粒体自噬对热应激条件下颗粒细胞凋亡的影响。研究结果为缓解蛋鸭养殖生产中的高温应激提供理论基础。本研究首先通过动物实验,研究了急性热应激对蛋鸭卵巢功能、细胞凋亡和线粒体自噬的影响。结果表明39℃的急性热处理可以造成蛋鸭卵巢组织损伤,诱导卵巢组织发生氧化应激,MDA含量显著增加。对血清中激素的检测结果显示,雌二醇合成下降而孕酮的合成水平上升。进一步的研究表明热应激抑制了St AR、3β-HSD和CYP19A1等关键类固醇合成酶的基因和蛋白的表达。Tunel和Western Blot结果显示,高温环境导致卵巢出现轻微的细胞凋亡,伴随热处理时间延长凋亡水平上升。进一步从超微结构水平对热应激条件下的颗粒细胞进行分析,结果表明热应激可以导致颗粒细胞线粒体结构损伤,并诱导细胞产生大量的双层膜和单层膜的自噬体样囊泡,部分囊泡中能观察到线粒体样结构。为了验证热应激条件下颗粒细胞线粒体自噬途径的活化过程,我们应用Western Blot技术对线粒体动力学及线粒体自噬的关键蛋白在细胞内的表达进行了分析。结果表明,热应激导致线粒体分裂蛋白Drp1表达增加,MFN1/2等线粒体融合蛋白减少,促进了PINK1的蛋白表达和LC3-I/LC3-II的转化。另外,P62的降解也表明,热应激可以显著提高细胞的自噬流量,促使细胞发生完全的线粒体自噬。在验证了急性热应激导致蛋鸭卵巢颗粒细胞线粒体自噬的基础上,为进一步研究线粒体自噬在颗粒细胞适应、存活中的作用,我们在体外培养的颗粒细胞上,建立了急性热应激致颗粒细胞线粒体自噬的研究模型。试验分别对颗粒细胞施加43℃急性热处理0、60、90、120、150 min,结果证实120 min以上热处理显著增加细胞内ROS含量。观察细胞超微结构发现细胞自噬体增加,进一步观察染色线粒体,发现急性热应激组细胞内线粒体形态缩短变圆,且分裂蛋白Drp1蛋白表达增加,线粒体融合蛋白减少。相比对照组,急性热应激处理的细胞核附近聚集了大量LC3蛋白斑点,同时全细胞、胞质和线粒体蛋白的Western Blot检测结果均说明急性热应激激活PINK1介导的线粒体自噬。此外,共聚焦结果观察到急性热应激组细胞线粒体与LC3斑点的共定位,及溶酶体与线粒体的共定位,显示自噬体和溶酶体在自噬过程中与线粒体的关系。我们还使用了线粒体自噬抑制剂Cys A处理急性热应激颗粒细胞,发现20μM Cys A可以有效抑制细胞自噬标记物LC3-I/LC3-II的转化。接下来我们利用si-RNA干扰Drp1、PINK1,研究抑制线粒体自噬对急性热应激下颗粒细胞凋亡的影响。结果显示抑制Drp1介导的线粒体分裂可以显著降低PINK1蛋白表达和LC3-I/LC3-II值,抑制P62降解,降低线粒体自噬。同时抑制Drp1增加了Bax/BCL2值和Caspase3蛋白表达,增强细胞凋亡。随后,我们的结果还证实抑制PINK1可显著降低LC3-I/LC3-II的转化和P62降解,进而降低线粒体自噬,促进细胞凋亡和相关蛋白表达显著增加。Tunel和Annexin-V检测结果表明抑制PINK1可以促进热应激诱导的细胞凋亡。综上所述,急性热应激导致蛋鸭卵巢颗粒细胞线粒体损伤、卵巢类固醇合成功能下降。细胞发生氧化应激,凋亡水平增加,同时热应激条件下线粒体自噬水平显著提高。进一步研究表明,PINK1蛋白介导了热应激诱导的线粒体自噬,线粒体自噬清除了受损线粒体,减少细胞凋亡,是机体在急性热应激下的自我保护机制。研究为进一步探讨热应激条件下颗粒细胞的适应存活机制提供了科学依据。