小麦单域TaFKBPs基因的克隆及功能验证

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小麦生产经常受到高温、干旱及土壤盐渍化等多种非生物逆境的严重影响。培育抗逆品种是抵御逆境胁迫的有效途径,但常规育种盲目性较大,而分子育种则具有针对性强,周期短等优势。抗逆分子育种的前提是研究和利用抗逆相关基因。前人研究发现,FK506结合蛋白(FK506 binding proteins,FKBPs)家族是一类分子伴侣,可以协助靶蛋白正确折叠或清除损伤的靶蛋白,从而提高细胞的抗逆性。FKBPs基因家族分为单域和多域基因,单域基因仅含有一个FK506结合结构域(FK506-binding domain,FKBd)。目前FKBPs基因家族在小麦中研究较少,单域FKBPs基因的研究更少。本研究对4个小麦单域TaFKBPs基因进行了逆境表达模式分析,克隆了其中3个基因,并对TaFKBP19-2AS基因进行了编码蛋白的亚细胞定位、启动子克隆及功能验证等研究,以期为小麦抗逆分子育种提供候选基因。主要研究结果如下:1.利用qRT-PCR方法,发现小麦TaFKBP19-2AS、TaFKBP16-2-6AL、TaFKBP16-3a和TaFKBP16-3b-7AS四个基因均受高温(38℃)诱导表达,其中TaFKBP19-2AS受高温诱导最敏感,诱导15min后其表达量迅速达到峰值,约为高温处理前的5.5倍。四个TaFKBPs基因在干旱胁迫下均下调表达,干旱处理12h后,TaFKBP16-3a基因的表达量降低到处理前的0.02倍。2.组织特异性表达分析表明,TaFKBP19-2AS、TaFKBP16-2-6AL和TaFKBP16-3a三个基因在小麦根、茎、叶、穗、外稃和内稃等组织中均有表达,叶中表达量最高。3.克隆了TaFKBP19-2AS、TaFKBP16-3a和TaFKBP16-3b-7AS三个基因的cDNA序列,全长依次是744bp、778bp和843bp,分别编码264、236和247个氨基酸。利用SMART在线软件发现三个基因都含有典型的FKBd保守域,说明该三个基因确实属于FKBPs家族。进化分析表明,这三个基因与二穗短柄草的同源基因亲缘关系最近,其次是水稻、玉米,与双子叶植物拟南芥和白菜的亲缘关系最远。4.构建了亚细胞定位载体16318h GFP-TaFKBP19-2AS,利用小麦原生质体转化的方法发现TaFKBP19-2AS定位在细胞质。5.克隆了TaFKBP19-2AS基因启动子,序列长1769bp,命名为PtaFKBP19。利用Plant CARE网站对PtaFKBP19进行顺式作用元件预测分析,发现含有分生组织特异性表达调控元件及ABRE(Abscisic acid response element)、ACE(ACGT-containing element)、HSE(Heat shock element)和LTR(Low temperature response element)等逆境相关元件。构建了植物表达载体pCambia1391Z-PtaFKBP19,通过农杆菌GV3101介导转入哥伦比亚野生型拟南芥中,转基因株系T1代进行GUS染色,结果在幼嫩组织发现有GUS染色信号,如新生叶的叶脉、叶柄和根尖部位,但在其余组织没有发现,说明该启动子确实具有分生组织表达特异性。6.构建了植物表达载体pCambia1302-TaFKBP19-2AS,获得过表达TaFKBP19-2AS的转基因拟南芥T3代。高温胁迫处理后,转基因拟南芥的存活率显著高于野生型,PEG10%模拟干旱胁迫处理后,转基因拟南芥的总生物量显著高于野生型,说明TaFKBP19-2AS基因的表达明显提高了转基因拟南芥的耐热性和抗旱性。7.利用qRT-PCR技术分析TaFKBP19-2AS基因对拟南芥耐热相关基因表达的影响,发现At Hsp23.6、At Hsp22.0、At Hsf A2等基因在转基因株系中表达量显著高于野生型拟南芥,这说明TaFKBP19-2AS基因可能通过参与包括热激蛋白和热激转录因子基因在内的基因网络调控拟南芥的抗逆性。
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