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目的腹膜透析相关性腹膜炎是腹膜透析过程中最常见的并发症。在腹膜透析相关性腹膜炎中,以革兰氏阳性菌感染为主。病理改变主要表现为腹膜层单核巨噬细胞浸润和腹膜间皮细胞外基质的沉积,最终导致腹膜透析失败。因此,如何对其进行防治一直是临床研究的热点。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）是一类可以识别保守的病原相关分子模式（pathogenassociated molecular patterns,PAMPs）的跨膜受体,是机体天然免疫的重要组成部分。通过对PAMPs的识别,TLRs在机体抵御病毒及病菌感染的过程中发挥重要的作用。迄今为止,在人类中鉴定出10种TOLL样蛋白（TLR1-10）。在这些TLRs中,TLR2和TLR6被发现与革兰氏阳性菌成分肽聚糖（peptidoglycan,PGN）和质膜酸（lipoteichoic acid,LTA）的识别有关。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）是80年代发现的巨噬细胞和单核细胞分泌的一种重要的细胞因子。具有多种生物效应,主要是介导抗肿瘤及调节机体的免疫功能,并且参与炎症病变的多方面病理生理变化。姜黄素是一种从姜科植物Curcuma longa的根茎姜黄中提取的一种植物多酚,有抗氧化、免疫调节、抗炎、抗凝、抗肿瘤、抗突变等多方面的药理作用研究表明,姜黄素作为一种免疫调节剂可以调控T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞等免疫细胞的活性与数量。姜黄素也可在一些炎症中下调一些炎性反应因子,如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）、白细胞介素（interleukin,IL）-1,-2,-6,-8,-12等。因此,本实验旨在研究姜黄素对表皮葡萄球菌所致的急性腹膜炎过程中TLR2、TLR6和TNF-α的表达的影响。材料与方法一、实验分组SD大鼠,雌雄并用,共72只,体重250-300g,随机分为2组,姜黄处理组和无姜黄处理组。每组内动物再分为6小组,除第1组给予等量生理盐水外,其余各组动物给予表皮葡萄球菌腹腔注射（107/ml colony-forming units,diluted in3.86%dialysate）制作急性腹膜炎模型。姜黄处理组在腹腔注射皮葡萄球菌前18小时给予姜黄素腹腔注射（1mg/kg）。实验动物存活3,6,12,24和48h后过量麻药处死,取腹水及眼血做常规腹水及血常规检测;取出腹膜处理备用。二、检测方法1、腹膜的组织学改变将切片置于苏木精染色液中15-20min,自来水冲洗;后切片置于0.5%HCL酒精中数秒,自来水洗3次后稍浸泡;切片置于伊红染色液中2-3min。切片脱水,中性树胶封片,光镜下观察结果。2、免疫组织化学检测实验动物麻醉后,常规灌流、固定、取材、切片,3%H2O2 10min,BSA封闭1h,TLR2、TLR6和TNF-α一抗孵育过夜（4℃）,二抗常温孵育2h,SABC常温孵育1h,DAB显色,3、TLR2、TLR6和TNF-α的蛋白质表达过量麻药处死动物,迅速取大脑并剥离海马,样品剪碎后加入裂解液4℃过夜。考马斯亮蓝法进行蛋白定量,各组取等量蛋白,聚丙酰胺凝胶电泳分离,并转至PVDF膜上;脱脂奶粉溶液封闭3-7h;TLR2、TLR6和TNF-α一抗孵育过夜（4℃）;二抗常温下孵育2h;后进行显色、曝光、胶片扫描、定量分析。4、TLR2、TLR6和TNF-α的mRNA表达采用Trizol一步法提取大鼠腹膜总RNA,然后进行逆转录。采用引物为:TLR2（5’-GGA GGT GTT GGA TGT TAG-3’;5’-GCT TGA AGG GTG GGT C-3’）;TLR6（5’-ACT CAC CAG AGG TCC AA-3’;5’-GGA TGA ATG GCG TGT C-3’）;TNF-α（5’-GCCACCACGCTCTTCTG-3’,5’-GCAGCCTTGTCCCTTGA-3’）。PCR扩增后,PCR扩增产物用3%琼脂糖凝胶进行电泳分离观察,成像,Image-pro Plus 6.0软件包分析。结果一、腹水白细胞检测结果腹腔注射表皮葡萄球菌后3小时,腹水白细胞开始升高。姜黄处理组与非姜黄处理组相比,姜黄素处理组腹水白细胞在腹腔注射表皮葡萄球菌后3h、6h、12h、24h数量减少且有统计学意义。二、HE染色结果实验动物腹腔注射表皮葡萄球菌后,腹膜出现水肿和细胞形态改变。选取腹腔注射表皮葡萄球菌后24h的腹膜切片对比,非姜黄素处理组腹膜间皮细胞损伤严重,细胞变形、碎裂;姜黄素处理组也存在一定程度的间皮细胞变形碎裂,但程度较非姜黄素处理组为轻。三、TLR2、TLR6和TNF-α免疫组织化学结果TLR2和TLR6免疫阳性反应主要位于腹膜间皮细胞。对于未注射表皮葡萄球菌的对照动物,姜黄素处理组与非姜黄素处理组TLR2和TLR6免疫阳性无明显差别。姜黄素处理组与非姜黄素处理组的实验动物在注射表皮葡萄球菌后3h,6h,12h,24h,TLR2和TLR6免疫组织化学染色逐渐增强其在感染后48h则有所减弱。而与非姜黄素处理组相比,姜黄素处理组TLR2和TLR6免疫组织化学染色在注射表皮葡萄球菌后3h,6h,12h,24h明显减弱,而在感染后48h则无明显区别。此外,姜黄素处理组的细胞形态明显好于非姜黄组处理组。TNF-α免疫染色自感染后3h开始逐渐加深,24小时达到高峰。与无姜黄素处理组相比,姜黄素处理组实验动物腹膜的免疫反应有着明显的减轻。四、TLR2、TLR6和TNF-α蛋白表达的Western-blot分析我们采用Western-blot技术对TLR2和TLR6的表达水平进行分析。在各个时间点,TLR2和TLR6的表达变化趋势令人吃惊的非常相似,统计结果表明TLR2和TLR6表达水平在感染后6h至24h呈时间依赖性上升。统计结果同时表明,与非姜黄素处理组相比,姜黄素处理组TLR2和TLR6表达含量在感染后6h/12h/24h明显下降且具有统计学意义。在各个时间点TNF-α表达水平在感染后3h至24h呈时间依赖性上升。同时与非姜黄素处理组相比,姜黄素处理组TNF-α表达含量在感染后6h/12h/24h明显下降且具有统计学意义。五、TLR2、TLR6和TNF-αmRNA表达的RT-PCR分析我们采用RT-PCR技术对TLR2和TLR6 mRNA水平表达进行了分析。在各个时间点,TLR2和TLR6 mRNA表达趋势是一致的,且其在感染后6h至24h呈时间依赖性上升。与非姜黄素处理组相比,姜黄素处理组TLR2和TLR6 mRNA表达明显减少并具有统计学意义。TNF-α的mRNA表达在感染后6h至24h呈时间依赖性上升。与非姜黄素处理组相比,姜黄素处理组TNF-αmRNA表达明显减少并具有统计学意义。结论1、正常大鼠腹膜存在少量TLR2、TLR6和TNF-α的表达。2、在表皮葡萄球菌诱发的腹膜透析相关性腹膜炎TLR2、TLR6和TNF-α的表达明显升高。3、姜黄素可抑制TLR2、TLR6和TNF-α过度表达,减轻了腹膜的组织损伤,说明其在由表皮葡萄球菌诱发的急性腹膜炎中具有保护作用。