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猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)可侵害断奶仔猪和育肥猪并能够引发多种与猪圆环病毒相关的疾病,是当前世界养猪业的巨大威胁,严重影响着养猪业的发展与进步。随着研究发现,病毒的各个血清型对猪体的抗原性、致病性以及基因同源性存在着及其明显的差异,因此人们将猪圆环病毒划分成猪圆环病毒1型(Porcine circovirus 1,PCV1)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)以及猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3,PCV3)三种基因型。已知PCV1无致病性,而PCV2有较强的致病性,是造成猪圆环病毒相关性疾病(Porcine circovirus-as sociated diseases,PCVADs)的主要病原,其中危害最严重的是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS),该病在我国乃至世界猪群中广泛存在,已成为一种常见病和多发病。PCV3感染可引发猪的皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍等,患病仔猪出现多系统炎症反应,导致器官功能紊乱,严重影响全世界的生猪养殖业的发展。由于PCV2与PCV3的衣壳蛋白氨基酸同源性低至30%,两种病毒间几乎不存在交叉免疫保护。目前,仍没有可同时预防和控制PCV2与PCV3的疫苗和药物。本研究将PCV2与PCV3的Cap蛋白利用杆状病毒表达系统融合表达,不仅有助于PCV2与PCV3的疫苗的研制,还可为研制诊断试剂盒提供蛋白。利用该系统同时表达PCV2 Cap蛋白与PCV3 Cap蛋白,并进行后续纯化及疫苗的研制,比传统方式更加安全有效,为病毒引起的相关疾病的控制和预防PCV的感染具有重要的意义。本研究共分为以下几个方面:2013-2018年山东省猪圆环病毒2型的遗传演化分析:为揭示近年来PCV2在山东省遗传演化情况,分析PCV2代表性优势毒株,为政府防控决策做进一步参考。我们分析了2013年至2018年在山东省上传到GenBank的40个PCV2基因组全序,使用MEGA V5.0软件构建全基因组进化树。系统进化树分析表明,山东省PCV2基因型的演化情况为:3种基因型共存(2a,2b,2d),发现目前PCV2d为主要流行毒株。通过对不同基因型ORF2编码的氨基酸序列分析,发现不同基因型中存在特定的氨基酸位点,主要分布在ORF2编码的81–160位氨基酸之间。PCV2 Cap蛋白与PCV3 Cap蛋白在杆状病毒表达系统中的表达:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统同时表达PCV2Cap和PCV3 Cap,并在重组序列前段加上一段蜂素信号肽序列便于其分泌表达。选用双启动子表达重组杆状病毒,间接免疫荧光结果显示重组杆状病毒能分别与鼠抗PCV2 Cap和鼠抗PCV3 Cap单抗特异性结合;基因组PCR鉴定结果显示,已成功扩增出与相应目的片段大小相符的特异性产物;Western-Blot鉴定可见分子量为70kD左右的蛋白条带;本实验运用杆状病毒表达系统成功表达出PCV2 Cap和PCV3 Cap蛋白,为表达融合蛋白提供新方法。重组杆状病毒的高效表达:将表达条件进行优化以促进重组蛋白高效表达。根据测定的P4代重组杆状病毒滴度结果,并分别以MOI=1,0.5,0.1感染sf9细胞,设置24h、48h、72h、96h、120h五个时间段来收获病毒液。经过实验优化后的融合蛋白获取条件为:MOI=0.1接种2.5×106个/mL的sf9细胞,接种后4天收获融合蛋白,平均表达量可达0.7mg/mL,最高表达量可达0.85mg/mL。该方法能够简单高效的表达PCV2 Cap和PCV3 Cap融合蛋白,是目前其他方法的表达量的2-8倍,极大的增加了表达效率,为进一步研制和生产PCV2、PCV3二联亚单位疫苗建立了良好的理论基础。