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研究背景:主动脉夹层(Aortic dissection,AD)是影响主动脉最常见最凶险的灾难性事件,致死率高,而且随着社会逐渐老龄化以及人民生活水平逐渐提高,其发病率呈逐渐增长的趋势。如今主动脉夹层的治疗多依赖手术治疗,但因其发病急骤而救治率较低,常常未能将夹层破裂等危险事件扼杀在摇篮里。因此主动脉夹层早期的良性干预及治疗显得尤为重要。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)作为血管内皮细胞(vascular endothelial cells,VECs)的前体细胞,诸多研究表明它参与了损伤血管的修复及新血管的形成,那么内皮祖细胞对于主动脉夹层是否具有明确的良性修复作用有待验证。研究目的:1.在临床样本上明确EPCs与主动脉夹层的相关性,以及EPCs在血管各层管壁结构中的含量及分布差异;2.提取原代EPCs,并在组织层面观察EPCs对于主动脉血管形成的作用;3.在活体动物模型上明确EPCs对于主动脉夹层的血管重构是否具有良性的促进作用,并进一步阐明其发挥作用的具体方式或机制,以期为主动脉夹层早期的干预及治疗提供新的策略和前景。研究方法:1.临床样本研究:经医学伦理委员会批准及患者知情同意后,收集主动脉夹层患者病理组织及遗体捐献者的正常主动脉组织,通过免疫荧光法检测组织中EPCs的特异性抗体CD34及VEGFR2,定量分析两组中EPCs的含量差异,以及EPCs在主动脉夹层组织及正常主动脉组织中不同管壁结构中的含量差异。2.小鼠原代内皮祖细胞的分离培养以及与主动脉组织共培养:取若干只4-8周龄野生型雄性C57BL/6小鼠,获取股骨骨髓单细胞悬液,通过密度梯度离心法提取其中的单个核细胞及少量EPCs,在EGM-2培养基中进行特定的诱导分化,培养为原代EPCs;通过流式细胞技术检测所EPCs的表面标志物sca-1、flk-1及CD133,以鉴定细胞免疫表型,明确所培养EPCs的纯度;通过免疫荧光法,观察EPCs吞噬乙酰化低密度脂蛋白和结合荆豆凝集素1的能力,以完成其功能鉴定;取小鼠主动脉,剪为1mm长的血管环,随机分为两组,分别在含有内皮祖细胞的培养基和对照培养基中进行培养,观察7d后主动脉环出芽数量及长度,并通过免疫荧光法观察出芽的组织成分。3.动物实验:将36只3周龄野生型雄性C57BL/6小鼠随机分为3组,分别为A.主动脉夹层造模对照(Model control group,MC)组、B.主动脉夹层造模+EPCs干预(Endothelial progenitor cell treatment,EPC)组及C.假手术(Shame operation,SO)组。AB两组均通过4周β-氨基丙腈(1g/kg/d)饮用水喂养+血管紧张素II微泵渗透3天的方法建立小鼠主动脉夹层模型,并在超声下监测主动脉夹层夹层形成情况;用CM-Di I染料对所培养鉴定后的EPCs进行标记,制为单细胞悬液后对B组造模完成的小鼠通过尾静脉注射2X10~6个EPCs,A、C组注射同体积生理盐水;于EPCs移植后3天,将B组小鼠置于活体成像仪下观察EPCs踪迹及分布;于EPCs移植后7天,在超声下测量A、B两组主动脉不同截面的直径;于EPCs移植后7天,3组小鼠各取6只于心尖注射伊文思蓝染液,观察主动脉再内皮化程度;其余小鼠均于EPCs移植后7天处死并解剖,取出完整的病理或正常的主动脉组织,比较各组大体标本上主动脉夹层形成情况及血管形态变化;将主动脉组织做冰冻切片示踪Dil-EPCs,观察其在血管壁的归巢情况;做石蜡切片通过HE染色观察对比各组主动脉结构变化情况及内膜生长情况;通过EVG染色下观察对比各组主动脉中膜弹力纤维含量;通过Masson染色观察对比各组主动脉胶原纤维含量。结果:1.临床样本实验中,收集了主动脉夹层组织及捐献的正常组织各7例,对每个视野中的EPCs含量进行定量,结果显示在主动脉夹层组织中的EPCs含量显著多于正常主动脉夹层组织,具有显著的统计学差异(P<0.05);主动脉夹层组织相较于正常主动脉组织,内膜及内中膜交界区的EPCs含量显著增多,具有显著的统计学差异(P<0.05),中膜区相比没有显著差异(P>0.05)。2.小鼠原代内皮祖细胞的分离培养以及与主动脉组织共培养:所提取EPCs按照贴壁-形成集落-长梭形-“鹅卵石”状的形态特点进行生长;流式细胞术检测显示所培养EPCs的表面标志物Sca-1、Flk-1和CD133所占比例分别为95.8%、91.9%和87.6%;所提取的EPCs具有吞噬乙酰化低密度脂蛋白和结合荆豆凝集素1的功能;原代EPC共培养组中的出芽数量(20.00±2.92)显著多于对照组(11.67±6.08),差异具有统计学意义(P<0.05);同时发现原代EPC共培养组的微血管长度(87.86±39.25μm)也显著多于对照组(62.53±31.57μm),两者比较差异具有统计学意义(P<0.05),新生出芽组织中既有内皮细胞又有平滑肌细胞。3.动物实验:EPC组和MC相比较,在截面2即主动脉弓第1截面处(1.27±0.08mm VS 1.40±0.13 mm),以及截面4即主动脉弓与胸降主动脉交界处(夹层的主要发生部位)(1.28±0.13mm VS 1.43±0.13 mm)相比,差异具有统计学意义(P<0.05);而截面1即升主动脉处(1.33±0.15mm VS 1.38±0.12 mm),以及截面3即主动脉弓第2截面处(1.22±0.16mm VS 1.27±0.14 mm)两组相比,MC组直径虽大于EPC组,但差异不具有统计学意义(P>0.05);将内膜生长面积进行量化,以SO组为1标准化为1,EPC组内膜面积为So组的53.36倍,差异显著具有统计学意义(P<0.05);MC组内膜面积约为SO组的0.8倍,差异不具有统计学意义(P>0.05);EPC组与MC组相比差异同样具有统计学意义(P<0.05);EPC组再内皮化程度显著高于MC组(83.18±4.22%VS 75.47±4.70%),差异具有统计学意义(P<0.05);EPC组小鼠主动脉胶原容积分数(45.50±7.21%)和SO组小鼠主动脉胶原容积分数(42.97±4.39%)明显高于MC组(26.38±4.96%),差异具有统计学意义(P<0.05);EPC组小鼠主动脉胶原容积分数相较于SO组无明显差异(45.50±7.21%VS 42.97±4.39%,P>0.05);EPC组(27.97±4.56%)和SO组小鼠(31.90±2.91%)主动脉弹力纤维含量显著高于MC组(21.05±7.11%),差异具有统计学意义(P<0.05);EPC组主动脉弹力纤维含量与SO组小鼠相比(27.97±4.56%VS 31.90±2.91%,P>0.05)无明显差异。结论:1.内皮祖细胞参与了主动脉夹层的病理生理过程,且可能的作用靶点在主动脉的内膜层及内中膜交界区。2.所提取细胞为标志性的EPCs。主动脉出芽实验明确EPCs具有促进进小鼠主动脉的血管形成的作用。3.外源性EPCs会归巢至主动脉夹层血管损伤部位,可以减轻主动脉夹层引起的血管扩张;EPCs可以促进主动脉内膜的生长,促进血管的再内皮化;EPCs可以提高夹层组织中胶原和弹力纤维的含量,对主动脉起一定的保护作用。