视神经脊髓炎谱系疾病（Neuromyelitis optica spectrum disorders,NMOSD）是一组自身免疫介导的以视神经和脊髓受累为主的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病,常于青壮年起病,临床上多以严重的视神经炎和纵向延伸的长节段横贯性脊髓炎为主要特征,复发率及致残率高。多数自身免疫性疾病具有女性相对高发的特点,在NMOSD中,女性的性别偏倚更为明显,其女男患病比例可高达（4.7～11）:1,然而出现该现象的确切机制尚未明确。探索NMOSD女性高发的分子机制,为揭示疾病本质、明确不同性别的个体化治疗方案具有重要意义。性别偏倚的免疫机制可能与激素、遗传、微生物和表观遗传效应等有关,但具体的分子机制尚不清楚。近年来,X染色体失活特异性转录本（X-inactive Specific Transcript,XIST）基因在性别相关的免疫调控机制中的作用逐渐被认识与关注。XIST基因定位于X染色体失活中心,表达为一个重要的lnc RNA Xist,能够调控雌性哺乳动物特有的基因剂量补偿机制——X染色体失活。该机制使雌性（XX）和雄性（XY）哺乳动物之间的X连锁基因剂量相近,包括诸多免疫调控相关基因。研究显示,在系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎中,lnc RNA Xist的差异可能与该类疾病的女性高发有关。但在NMOSD中,尚无研究探索过lnc RNA Xist在其免疫调节机制中的作用。探究lnc RNA Xist在NMOSD及同样存在雌性偏倚及Th17相关致病机制的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型小鼠中的免疫调控机制可能为明确该类疾病的女性偏倚的发病机制提供新思路。有研究显示,lnc RNA Xist可能与反式反应DNA结合蛋白（Transactive response DNA-binding protein,TARDBP,又名TDP43）存在互作,TDP43是一种参与RNA代谢的核蛋白。研究显示,TDP43可被剪接形成其活性形式TDP35,后者能够靶向抑制干扰素调节因子3（Interferon regulatory factor 3,IRF3）的降解,而IRF3则是Th17分化的重要推动者。另一方面,近年来研究发现,表观遗传学效应在调控T细胞亚群的特异性及可塑性中至关重要。其中,组蛋白H3的第27个氨基酸上三甲基化（Histone H3 tri-methylated at K27,H3K27me3）是重要的基因转录抑制修饰。而赖氨酸特异性去甲基酶6A（Lysine-specific demethylase 6A,KDM6A）是H3K27me3的特异性脱甲基酶,其表达量改变可能会通过去甲基化H3K27me3来调控下游基因的表达。有研究显示,T细胞特异性衔接蛋白（T cell-specific adaptor protein,TSAd）启动子区域中H3K27me3标记富集后,所导致的TSAd低表达会促进小鼠脾脏来源的CD4+na?ve T细胞向Th17分化。而Th17细胞的增多则有可能导致了NMOSD及EAE等疾病过程中的中枢神经系统炎症。基于以上文献基础我提出假设,lnc RNA Xist可能通过TDP43-IRF3及KDM6A-TSAd两种途径对Th17的分化产生影响,进而促进NMOSD及EAE等疾病中炎性脱髓鞘的发生。本研究从ce RNA芯片及单细胞测序等转录组学分析出发,初步探索了这些指标的差异表达情况,并通过临床及实验动物标本来进行低通量验证,探讨了相关指标在疾病过程中的表达情况以及部分指标间的相互作用关系,从而进一步了解lnc RNA Xist在NMOSD及EAE中的作用机制,为中枢神经系统脱髓鞘疾病的机制研究提供了新思路。第一部分视神经脊髓炎谱系疾病患者外周血单个核细胞及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠胸腺的转录组学分析目的:从NMOSD患者外周血单个核细胞（PBMC）ce RNA芯片及EAE小鼠胸腺单细胞测序等转录组学分析出发,探究lnc RNA Xist等相关指标的差异表达情况,为进一步验证lnc RNA Xist-TDP43-IRF3及lnc RNA Xist-KDM6A-TSAd等相关通路在中枢神经系统脱髓鞘疾病过程中的作用奠定基础。方法:1.选取实验对象:1)NMOSD患者:从河北医科大学第二医院神经内科连续招募符合纳入及排除标准的未经抗炎治疗或免疫抑制治疗的女性急性NMOSD患者以及年龄性别匹配的健康对照者,抽取外周血并记录临床信息;2)EAE小鼠:选取6-8周龄的SPF级雌性C57BL/6小鼠,体重为20±2g,将C57BL/6小鼠饲养于室内温度为24±2℃、相对湿度为50%-60%的清洁环境中,每日明暗环境各12小时,适应性饲养1周后随机分为空白对照组及EAE组。2.EAE动物模型的建立、评分及取材:用生理盐水将MOG35-55多肽稀释,配制为10mg/ml的溶液。加入等体积的完全弗氏佐剂,并加入结核杆菌H37Ra使其浓度达到4mg/ml。混合液充分乳化后形成油包水乳剂,在小鼠背部脊柱两侧任意四点进行皮下注射,每只0.1ml。随后分别在免疫第0h及第48h给予小鼠0.5ml百日咳毒素腹腔注射。随后开始每天使用Jager法（5分法）对两组小鼠进行神经功能评分。于免疫后第20天左右,从发病达高峰期（3分及以上）的EAE小鼠中随机选择一只,另从Control组随机选择一只,取出胸腺后置于冻存液中,梯度冻存于-80℃冰箱中冷冻待用。3.NMOSD患者及健康对照者PBMC的提取及RNA提取:使用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法提取新鲜外周血中的单个核细胞,并使用RNA分离试剂盒提取其中的总RNA。4.对NMOSD患者及健康对照组的PBMC进行ce RNA芯片检测,对小鼠胸腺组织进行单细胞转录组测序,并分析结果。结果:1.人口学及一般资料:本研究共纳入了14名受试者。其中,符合纳入排除标准的急性NMOSD患者7名,年龄性别匹配的健康对照者7名,两组年龄无统计学差异（P=0.163）。2.ce RNA芯片结果分析:NMOSD患者PBMC与Control组相比,共有1930个m RNA（其中879个上调,1051个下调）、3665个lnc RNA（其中1464个上调,2201个下调）、3155个circ RNA（其中2178个上调,977个下调）的表达量存在统计学显著性差异（P＜0.05且Fold Change＞2.0）;其中,NMOSD组lnc RNA Xist显著下调（P=0.0008）,KDM6A显著下调（P=0.0007）,TSAd显著下调（P=0.0414）,TDP43无显著改变（P=0.7239）,IRF3显著升高（P＜0.0001）;而X染色体上差异表达m RNA与lnc RNA Xist表达量的相关性最高的是KDM6A（r=0.9400,P＜0.0001）。3.单细胞转录组测序结果分析:EAE组与Control组相比,有173个基因表达显著上调,370个基因表达显著下调（P＜0.05且Fold Change＞1.5）;对取材后的Control及EAE小鼠胸腺进行观察可发现EAE组胸腺出现了明显萎缩;降维聚类分析显示胸腺中的细胞以不同类型的T细胞为主,另有少量的B细胞、胸腺上皮细胞、树突状细胞等;EAE小鼠胸腺较Control小鼠DN细胞及CD4 SP、CD8 SP显著增多,而发育中间形态的DP细胞比例减少;EAE小鼠胸腺CD4 SP细胞中的Xist（P＜0.0001）,KDM6A（P＜0.0001）、TDP43（P＜0.0001）、TSAd（P＜0.0001）均较Control组显著降低,IRF3较对照组显著升高（P＜0.0001）。结论:本部分研究通过对女性NMOSD急性期患者PBMC进行ce RNA芯片检测以及对EAE小鼠胸腺进行单细胞转录组测序,发现在ce RNA芯片结果中,NMOSD组的lnc RNA Xist显著下调,X染色体上与lnc RNA Xist表达水平相关性最高的m RNA为KDM6A;在单细胞测序结果中,发现EAE小鼠胸腺中CD4 SP及CD8 SP细胞比例显著升高,且CD4 SP细胞中lnc RNA Xist亦显著下调,其他本研究相关的RNA水平也基本与前期假设一致,为后续进一步的实验验证奠定了基础。第二部分Lnc RNA Xist-TDP43-IRF3通路在中枢神经系统脱髓鞘中的作用机制研究目的:本部分研究将从女性NMOSD急性期患者PBMC和EAE小鼠胸腺入手,探索lnc RNA Xist-TDP43-IRF3通路在中枢神经系统脱髓鞘状态下的表达改变,为NMOSD性别差异及发病机制相关研究提供新思路。方法:1.选取实验对象:1)NMOSD患者:从河北医科大学第二医院神经内科连续招募符合纳入及排除标准的未经抗炎治疗或免疫抑制治疗的女性急性NMOSD患者以及年龄性别匹配的健康对照者,抽取外周血并记录临床信息;2)EAE小鼠:选取6-8周龄的SPF级雌性C57BL/6小鼠,体重为20±2g,将C57BL/6小鼠饲养于室内温度为24±2℃、相对湿度为50%-60%的清洁环境中,每日明暗环境各12小时,适应性饲养1周后随机分为空白对照组及EAE组。2.EAE动物模型的建立、评分及取材:用生理盐水将MOG35-55多肽稀释,配制为10mg/ml的溶液。加入等体积的完全弗氏佐剂,并加入结核杆菌H37Ra使其浓度达到4mg/ml。混合液充分乳化后形成油包水乳剂,在小鼠背部脊柱两侧任意四点进行皮下注射,每只0.1ml。随后分别在免疫第0h及第48h给予小鼠0.5ml百日咳毒素腹腔注射。随后开始每天使用Jager法（5分法）对两组小鼠进行神经功能评分。于免疫后第20天左右,发病达高峰期（3分及以上）时取材,拟用于做Western blot的样本放入液氮中迅速冷冻,后置于-80℃冰箱中保存;拟用于做RT-q PCR的样本加入1ml Trizol,研磨吹打至裂解后,于-80℃冰箱保存待用。3.NMOSD患者及健康对照者PBMC的提取:使用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法提取新鲜外周血中的单个核细胞,拟用于做Western blot的样本直接将PBMC沉淀冻存于-80℃冰箱待用;拟用于做RT-q PCR的样本加入1ml Trizol,反复吹打至单个核细胞充分裂解成均匀的溶液,于-80℃冰箱保存待用。4.提取RNA并用RT-q PCR方法检测NMOSD的PBMC及EAE胸腺中lnc RNA Xist和m RNA IRF3、TDP43的表达情况。5.提取蛋白并用Western blot方法检测NMOSD的PBMC及EAE胸腺中IRF3、TDP43及其活性剪接体TDP35蛋白表达情况。结果:1.人口学及一般资料:本研究共纳入了44名受试者。其中,符合纳入排除标准的急性NMOSD患者22名,年龄性别匹配的健康对照者22名,两组年龄无统计学差异（P=0.796）。2.小鼠发病情况:EAE组小鼠在免疫后第11天起开始发病,于第20天取材时评分均值达到3.233±0.799分,发病率为100%。3.RNA表达情况:NMOSD组的lnc RNA Xist表达量较对照组显著下降（P=0.0051）,TDP43 m RNA表达量较对照组升高但未达到统计学显著性（P=0.0908）,IRF3 m RNA较对照组显著下降（P＜0.0001）。EAE组的lnc RNA Xist表达量较对照组显著下降（P＜0.0001）,TDP43 m RNA表达量较对照组无明显变化（P=0.9257）,IRF3 m RNA较对照组显著升高（P=0.0367）。4.蛋白表达情况:NMOSD组的TDP43蛋白表达量较对照组无明显差别（P=0.7000）,其剪接形态TDP35较对照组显著升高（P=0.0013）,NMOSD组的IRF3蛋白较对照组显著下降（P=0.0081）。EAE组的TDP43蛋白表达量较对照组无明显变化（P=0.1885）,其剪接形态TDP35蛋白表达量较对照组有所升高但未达到统计学显著性差异（P=0.0922）,EAE组的IRF3蛋白表达量较对照组显著升高（P=0.0066）。结论:本部分研究从女性NMOSD急性期患者PBMC和EAE小鼠胸腺入手,探索了lnc RNA Xist-TDP43-IRF3通路在中枢神经系统脱髓鞘疾病中的表达情况。发现lnc RNA Xist下调后可能释放了更多的TDP43并被剪接为其活性形式TDP35,TDP35的增多抑制了IRF3降解从而导致其升高,进而促进了中枢神经系统炎症。本研究结果进一步揭示了lnc RNA Xist在中枢神经系统炎症中的免疫调节作用以及对性别偏倚的影响,为该类疾病的研究与治疗提供了新思路。第三部分Lnc RNA Xist-KDM6A-TSAd通路在中枢神经系统脱髓鞘中的作用机制研究目的:本部分实验旨在明确疾病与健康状态下lnc RNA Xist-KDM6ATSAd通路表达量的变化以及H3K27me3对TSAd的修饰作用变化,拟进一步阐明lnc RNA Xist对于NMOSD及EAE等中枢神经系统脱髓鞘疾病的调控机制。方法:1.实验对象选择及取材:沿用第二部分的所采集的NMOSD患者PBMC样本及EAE小鼠胸腺样本。2.用RT-qPCR方法检测NMOSD的PBMC及EAE胸腺中KDM6A、TSAd m RNA的表达情况。3.用Western blot方法检测NMOSD的PBMC及EAE胸腺中KDM6A、TSAd表达情况。4.用荧光原位杂交联合免疫荧光的方法检测NMOSD的PBMC中lnc RNA Xist与H3K27me3的定位模式。5.使用染色质免疫共沉淀方法检测并比较NMOSD与Control的PBMC中TSAd基因近端启动子区域随机2个部位的H3K27me3富集情况。结果:1.RNA表达情况:NMOSD组的KDM6A表达量较对照组显著下降（P=0.0455）,TSAd较对照组显著下降（P＜0.0001）。EAE组的KDM6A表达量较对照组显著下降（P=0.0136）,TSAd较对照组无统计学显著性差异（P=0.2892）。2.蛋白表达情况:NMOSD组的KDM6A蛋白表达量较对照组显著下降（P=0.0253）,TSAd蛋白较对照组显著下降（P=0.0026）;EAE组的KDM6A蛋白表达量较对照组有较明显下降趋势但未达到统计学显著性（P=0.089）,TSAd较对照组无显著性差异（P=0.4059）。3.KDM6A与lnc RNA Xist的相关性分析:使用Spearman相关性分析探究了二者在NMOSD患者PBMC以及EAE小鼠胸腺中的转录水平相关性,结果显示m RNA KDM6A与lnc RNA Xist在NMOSD中（r=0.5658,P=0.0049）以及EAE中（r=0.5588,P=0.0266）均呈显著正相关。4.荧光原位杂交联合免疫荧光分析显示:lnc RNA Xist在Control组的PBMC细胞核内表达更高,而在NMOSD组较低;而H3K27me3修饰则在NMOSD中较高而在Control组较低。从共定位情况来看,两组的lnc RNA Xist与H3K27me3共定位比例均较低,其中在NMOSD中更低。5.染色质免疫共沉淀分析显示:NMOSD组PBMC中TSAd启动子区域2个部位的H3K27me3修饰均较对照组明显升高。结论:本部分研究从女性NMOSD急性期患者PBMC和EAE小鼠胸腺入手,探索了lnc RNA Xist-KDM6A-TSAd通路在中枢神经系统脱髓鞘疾病中的表达情况。发现随着lnc RNA Xist的下调,KDM6A表达量显著降低,从而增加了TSAd基因启动子区域的H3K27me3修饰,抑制了TSAd表达,进而可能通过促进Th17细胞分化来增强了NMOSD及EAE疾病过程中的炎症反应。本研究结果进一步揭示了lnc RNA Xist在中枢神经系统炎症中的免疫调节作用以及对性别偏倚的影响,也为疾病的治疗提供了新切入点。