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目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常见的慢性微血管并发症之一,也是导致终末期肾功能衰竭的主要原因。在糖尿病肾病早期,肾小球滤过率和尿白蛋白排泄率明显升高。足细胞由细胞体、主突和足突组成,是肾小球中高度分化的终末细胞。两个相邻足突之间形成的裂孔隔膜是肾小球滤过屏障的重要结构和功能单位。由于足细胞的增殖再生能力有限,故需要丰富的线粒体为其提供能量,以维持细胞正常的结构和功能。有研究报道,线粒体功能障碍将导致足突融合和消失,与肾小球滤过屏障的破坏和蛋白尿的形成密切相关。因此,线粒体功能障碍可能是导致DN足细胞损伤的重要致病机制。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator 1-alpha,PGC-1α)是线粒体生物发生和功能的关键转录因子。PGC-1α在线粒体生物合成、能量代谢、适应性产热、细胞衰老和细胞增殖与凋亡等方面发挥着重要的调节作用。PGC-1α的转录活性受多种翻译后修饰的影响,如磷酸化、乙酰化和甲基化等。其中磷酸化是PGC-1α的主要翻译后修饰之一。研究发现,p70核糖体蛋白S6激酶1(p70 ribosomal protein S6 kinase 1,p70 S6K1)磷酸化PGC-1α的Ser568和Ser572,从而特异性地抑制糖异生基因的表达。不仅如此,蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)可以直接磷酸化PGC-1α的Ser570,降低PGC-1α的转录活性和蛋白稳定性,从而促进血管紧张素Ⅱ诱导的活性氧产生和血管肥大。可见,PGC-1α的磷酸化修饰对疾病的发生发展具有重要的意义。因此,寻找PGC-1α的上游磷酸化激酶对明确糖尿病肾病的发病机制起着关键的作用。细胞周期素蛋白依赖性激酶5(Cyclin-dependent Kinase 5,Cdk5)是一种由脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Cdk5普遍存在于哺乳动物组织中,具有高度的保守性。Cdk5可以特异性地磷酸化包含有(S/T)PX(H/K/R)序列的底物蛋白,发挥对蛋白功能的调节作用。本课题组前期实验表明,在高糖条件下,Cdk5过度激活可以引起线粒体功能障碍、活性氧增加,最终导致足细胞损伤,参与糖尿病肾病的发生发展。然而,Cdk5导致线粒体功能障碍的具体机制尚未完全清楚。那么,PGC-1α是否可以作为Cdk5的磷酸化底物,在高糖环境下被过度磷酸化,从而引起足细胞线粒体功能障碍,参与糖尿病肾病的发生发展。本研究以人足细胞(Human podocytes,HPCs)为研究对象,深入探讨PGC-1α磷酸化在糖尿病肾病足细胞损伤中的作用及调控机制,确定其对足细胞线粒体功能障碍的影响,为进一步阐明糖尿病肾病的发病机制,探索靶向治疗的方法提供科学依据。方法:1.高糖促进Cdk5和PGC-1α的蛋白相互作用⑴高糖对PGC-1α磷酸化水平的影响。以HPCs为研究对象,随机分为3组:对照组(5.5 mmol/L glucose,C)、高糖刺激24小时组(30 mmol/L glucose,HG 24 h)和高糖刺激48小时组(30 mmol/L glucose,HG 48 h)。干预结束后收集细胞,IP和Western blot检测PGC-1α的磷酸化水平。⑵高糖条件下Cdk5和PGC-1α的蛋白相互作用。将HPCs随机分为3组:对照组(C)、甘露醇组(5.5 mmol/L glucose+24.5mmol/L mannitol,M)和高糖组(HG),Co-IP和Western blot检测高糖条件下Cdk5和PGC-1α的蛋白相互作用。2.高糖通过Cdk5促进PGC-1α蛋白的磷酸化⑴抑制Cdk5对高糖培养的HPCs中PGC-1α蛋白磷酸化水平的影响。(1)将HPCs随机分为2组:高糖组(HG)和高糖+抑制剂组(HG+5μmol/L Roscovitine,HG+R),各组于干预24 h后收集细胞,IP和Western blot检测PGC-1α磷酸化水平。(2)将HPCs随机分为2组:高糖转染对照组(HG+pc DNA3.0)和高糖+敲除Cdk5质粒转染组(HG+DN-Cdk5),当细胞融合至70%-80%时转染质粒,孵育6-8 h后,加入30 m M高糖,24 h后收集细胞,IP和Western blot检测PGC-1α的磷酸化水平。⑵过表达Cdk5对HPCs中PGC-1α蛋白磷酸化水平的影响。将HPCs随机分为4组:转染对照组(pc DNA3.0),过表达Cdk5+过表达p25质粒转染组(Cdk5/p25),过表达Cdk5质粒转染组(WT-Cdk5)和过表达p25质粒转染组(WT-p25),当细胞融合至70%-80%时转染质粒,孵育6-8 h后收集细胞,IP和Western blot检测PGC-1α的磷酸化水平。⑶体外激酶反应检测PGC-1α的磷酸化水平。3.Cdk5促进PGC-1α在Thr299位点磷酸化⑴Scansite软件分析Cdk5对PGC-1α蛋白磷酸化的位点以及序列保守性。⑵体外激酶反应检测PGC-1α的磷酸化水平。4.抑制PGC-1αThr299位点磷酸化可以减轻高糖引起的足细胞线粒体功能障碍⑴将HPCs随机分为6组:转染对照组(pc DNA3.0),过表达PGC-1α质粒转染组(WT-PGC-1α),高糖转染对照组(HG+pc DNA3.0),高糖+过表达PGC-1α质粒转染组(HG+WT-PGC-1α),高糖+PGC-1α-T299A质粒转染组(HG+PGC-1α-T299A),PGC-1α-T299D质粒转染组(PGC-1α-T299D),当细胞融合至70%-80%时转染质粒,孵育6-8 h后,加入30 m M高糖,24 h后收集细胞,IP和Western blot检测PGC-1α的磷酸化水平。⑵将HPCs随机分为5组:转染对照组(pc DNA3.0),高糖转染对照组(HG+pc DNA3.0),高糖+过表达PGC-1α质粒转染组(HG+WT-PGC-1α),高糖+PGC-1α-T299A质粒转染组(HG+PGC-1α-T299A),PGC-1α-T299D质粒转染组(PGC-1α-T299D),当细胞融合至70%-80%时转染质粒,孵育6-8h后,加入30 m M高糖,24 h后收集细胞:(1)Western blot方法检测nephrin、SOD2、Cyto-C的表达水平。(2)Mitotracker染色,激光共聚焦观察线粒体形态。(3)JC-1染色检测活细胞线粒体膜电位的变化。(4)检测ATP生成。结果:1.高糖促进Cdk5和PGC-1α的蛋白相互作用⑴高糖培养的HPCs中,PGC-1α蛋白表达显著降低,其磷酸化水平明显增高,且于24 h增高较为显著。⑵高糖培养的HPCs中,PGC-1α蛋白表达水平明显降低,Cdk5蛋白表达水平显著升高。Co-IP结果显示,高糖显著增强Cdk5与PGC-1α之间的相互结合。2.高糖通过Cdk5促进PGC-1α蛋白的磷酸化⑴抑制Cdk5对高糖培养的HPCs中PGC-1α蛋白磷酸化水平的影响。(1)结果显示,与HG组相比,HG+R组中PGC-1α蛋白表达水平升高,其磷酸化水平明显降低。(2)与HG+pc DNA3.0组相比,HG+DN-Cdk5组中PGC-1α蛋白表达水平升高,其磷酸化水平显著降低。以上结果提示,高糖通过增强Cdk5表达及激酶活性,不仅促进了足细胞中PGC-1α的磷酸化,而且显著抑制了PGC-1α的表达。⑵过表达Cdk5对HPCs中PGC-1α蛋白磷酸化水平的影响。结果显示,与pc DNA3.0组相比,Cdk5/p25组、WT-Cdk5组中PGC-1α蛋白表达水平明显降低,单独转染WT-p25对PGC-1α表达抑制作用则不显著。IP结果显示,与pc DNA3.0组相比,Cdk5/p25组、WT-Cdk5组和WT-p25组中PGC-1α磷酸化水平均明显升高,且在p25存在下升高更为显著。提示,过表达Cdk5可以显著促进PGC-1α蛋白磷酸化。⑶体外激酶反应结果显示,Cdk5可以磷酸化PGC-1α。3.Cdk5促进PGC-1α在Thr299位点磷酸化⑴Scansite软件分析结果显示,Cdk5可以导致PGC-1αThr299位点的磷酸化,并且该序列具有高度的保守性。⑵体外激酶反应结果显示,将PGC-1α第299位苏氨酸(T)突变为丙氨酸(A)后,显著抑制Cdk5对PGC-1α的磷酸化作用。4.抑制PGC-1αThr299位点磷酸化可以减轻高糖引起的足细胞线粒体功能障碍⑴Western blot结果显示,高糖培养的HPCs中,PGC-1α表达水平显著降低,转染PGC-1α质粒组中PGC-1α蛋白表达水平均升高。IP结果显示,与pc DNA3.0组相比,高糖显著促进PGC-1α磷酸化。与HG+pc DNA3.0组相比,HG+WT-PGC-1α组中PGC-1α磷酸化水平明显增高,而转染PGC-1α-T299A质粒可显著抑制PGC-1α的磷酸化。⑵Western blot结果显示,与pc DNA3.0组相比,HG+pc DNA3.0组及PGC-1α-T299D组中nephrin和SOD2蛋白水平明显降低,Cyto-C蛋白水平明显升高;与HG+pc DNA3.0组相比,HG+WT-PGC-1α组和HG+PGC-1α-T299A组中nephrin和SOD2蛋白表达水平升高,其中以HG+PGC-1α-T299A组升高更为显著,Cyto-C蛋白表达水平降低。提示,抑制PGC-1αThr299磷酸化可以提高线粒体抗氧化能力、减少凋亡以及足细胞损伤。⑶Mitotracker染色结果显示,与HG+pc DNA3.0组相比,HG+PGC-1α-T299A组中足细胞线粒体形态由碎片化恢复为细长、杆状;JC-1染色结果显示,与HG+pc DNA3.0组相比,HG+PGC-1α-T299A组线粒体膜电位显著升高;ATP检测结果显示,与HG+pc DNA3.0组相比,HG+PGC-1α-T299A组中ATP水平显著增高。以上结果提示,抑制PGC-1αThr299磷酸化可以减轻由高糖诱导的线粒体功能障碍。结论:1.高糖增强Cdk5表达及激酶活性,促进PGC-1α在Thr299位点磷酸化。2.抑制PGC-1αThr299位点磷酸化可以减轻高糖引起的足细胞线粒体功能障碍。