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目的:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是重症糖尿病导致的微血管病变并发症之一,也是引起终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的重要原因。足细胞(Podocytes)位于肾小球毛细血管基底膜外侧,其胞浆在基底膜表面形成伪足样突起,突起之间的裂孔膜(Split mernbrane)是肾小球发挥滤过功能的最后一道屏障。糖尿病肾病患者早期肾小球内足细胞损伤是导致蛋白尿产生的重要原因。目前,关于足细胞损伤在糖尿病肾病的发病机制中起到的作用尚未明确。细胞周期蛋白依赖激酶5(Cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)是一种脯氨酸导向的丝氨酸/苏氨酸激酶,能对真核细胞分裂周期中的磷酸/脱磷酸化过程发挥调控作用。Cdk5存在于毛细血管袢阶段到成熟阶段的足细胞中,也存在于成年肾小球的足细胞中,其表达水平与足细胞的增殖、分化和正常形态的维持密切相关。前期研究结果显示,异常活化的Cdk5可通过促进线粒体氧化应激,诱导线粒体功能障碍,加重足细胞损伤。Cdk5在足细胞损伤中的具体机制还不清楚。Micro RNA(mi RNA)是内源性非编码RNA(non-coding RNAs,nc RNAs),可以通过促进靶m RNA的降解或阻碍翻译进而调节基因的表达,是重要的转录后调节因子。越来越多研究表明糖尿病肾病发生与发展的整个过程伴随着多种mi RNA的异常表达。通过全数据库预测筛选分析,我们发现mi R-4645-3p可结合到Cdk5的3’UTR,其可能对Cdk5基因的表达存在调节作用,因此本研究拟以糖尿病肾病患者肾活检组织与人源足细胞(Human podocytes,HPCs)为研究对象,探究mi R-4645-3p在糖尿病肾病肾小球足细胞损伤中发挥的作用,为明确糖尿病肾病的相关发病机制和探索靶向治疗糖尿病肾病提供实验和理论依据。方法:1.探究糖尿病肾病患者和高糖刺激的足细胞中mi R-4645-3p表达的改变。⑴收集河北医科大学第二医院肾内科确诊糖尿病肾病患者肾活检组织标本20例。另选取20例因肾癌行肾切除术病例,选取远离肿瘤组织并且经病理诊断为正常肾的组织作为对照组。荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)和Nestin共定位观察肾活检组织标本肾小球足细胞中mi R-4645-3p的表达变化。⑵将人源原代肾足细胞(HPCs)分为对照组、甘露醇(30 m M)组、高糖(30 m M)组培养,利用FISH和q RT-PCR方法检测各组人原代足细胞中mi R-4645-3p的表达变化。⑶对9周龄的CD-1小鼠进行单次腹腔注射150mg/kg的STZ诱导I型糖尿病,对照组小鼠注射等量的溶媒(0.1m M柠檬酸缓冲液,PH值为4.5),以空腹血糖浓度连续3次检测超过11.1m M被确认为糖尿病小鼠。24周龄时取糖尿病小鼠肾脏组织提取总m RNA,以正常CD-1小鼠肾脏组织总m RNA为对照组,采用q RT-PCR方法检测mi R-4645-3p的表达变化。2.探究mi R-4645-3p在足细胞损伤中的作用。⑴将HPCs分为转染对照组(mi R-NC)、mi R-4645-3p过表达组(mimics组,mi R-4645-3p的模拟物组,可诱导足细胞中mi R-4645-3p的高表达)以及mi R-4645-3p抑制组(inhibitor组,反义核酸分子组,可抑制足细胞中mi R-4645-3p的表达)。细胞生长密度达70%时分别转染mi R-NC,mimics和inhibitor,并给予普通培养基孵育48h后收集细胞。q RT-PCR检测mimics的转染效率,Western blot检测Synapotopodin、Nephrin、TGF-β1、PGC-1α、Cyto-c、p-DRP1、DRP1蛋白的表达变化。通过流式细胞术检测足细胞的凋亡率。通过检测线粒体形态和膜电位观察足细胞形态以及功能的变化情况。3.探究mi R-4645-3p在高糖诱导的足细胞损伤和凋亡过程中起到的作用。⑴将HPCs分为转染对照组(mi R-NC)、mi R-4645-3p过表达组(mimics)。细胞生长密度达70%时分别转染mi R-NC,mimics并给予高糖(30 m M)培养基孵育48 h后收集细胞。Western blot检测Synapotopodin、Nephrin、TGF-β1、PGC-1α、Cyto-c、p-DRP1、DRP1蛋白的表达变化。通过流式细胞术检测足细胞的凋亡率。通过检测线粒体形态和膜电位观察足细胞形态以及功能的变化情况。4.探究mi R-4645-3p对Cdk5基因表达的靶向抑制作用。⑴通过全转录组基因测序分析,发现mi R-4645-3p在高糖刺激的足细胞中显著降低,生物信息学分析结果显示,Cdk5是mi R-4645-3p的靶基因之一,mi R-4645-3p可以同Cdk5的3’UTR区相结合。⑵以人肾上皮细胞系(HEK293a)为研究对象,将HEK293a分为转染对照组(mi R-NC+MUT-cdk5)、(mi R-NC+WT-cdk5)、(mimics+MUT-cdk5)、(mimics+WT-cdk5)进行双荧光素酶报告基因检测荧光素表达的高低。⑶将HPCs分为转染对照组(mi R-NC)、mi R-4645-3p过表达组(mimics)。细胞生长密度达70%时分别转染mi R-NC和mimics,并给予普通培养基孵育48h后收集细胞。q RT-PCR检测Cdk5 m RNA表达情况,Western blot检测Cdk5蛋白表达水平。⑷将HPC分为转染对照组(mi R-NC)、mi R-4645-3p过表达组(mimics)。细胞生长密度达70%时分别转染mi R-NC,mimics,并给予高糖(30m M)培养基孵育48h后收集细胞。q RT-PCR检测Cdk5 m RNA表达情况,Western blot检测CDK5蛋白表达水平。5.探究mi R-4645-3p在足细胞中减轻Cdk5介导的线粒体损伤作用。⑴将HPCs分为转染对照组(pc DNA3.0+mi R-NC)、mi R-4645-3p过表达组(pc DNA3.0+mimics)、WT-Cdk5过表达组(WT-Cdk5+mi R-NC)、mi R-4645-3p和WT-Cdk5共表达组(WT-Cdk5+mimics)。细胞生长密度达70%时分别转染mi R-NC、mimics、pc DNA3.0、WT-Cdk5,孵育48h后收集细胞。Western blot检测Synapotopodin、Nephrin、TGF-β1、PGC-1α、Cyto-c、p-DRP1、DRP1蛋白的表达变化,流式细胞术检测细胞凋亡。通过检测线粒体形态和膜电位观察足细胞形态以及功能的变化情况。结果:1.mi R-4645-3p在糖尿病足细胞中的表达。⑴FISH染色显示糖尿病肾病患者肾小球足细胞和高糖处理足细胞中mi R-4645-3p的表达显著降低。⑵q RT-PCR结果显示高糖处理的足细胞和糖尿病小鼠肾组织中mi R-4645-3p的含量显著下降。2.mi R-4645-3p在线粒体功能障碍和足细胞损伤中的作用。⑴转染mi R-4645-3p mimics能显著增强足细胞标志物Synapotopodin和Nephrin,线粒体相关蛋白PGC-1α表达;显著抑制TGF-β1和线粒体损伤蛋白Cyto-c表达。⑵mi R-4645-3p对足细胞线粒体的形态维持和膜电位正常起保护作用,而抑制mi R-4645-3p能够显著促进足细胞的损伤和凋亡。3.mi R-4645-3p在高糖处理足细胞中的影响⑴mi R-4645-3p能显著改善高糖刺激导致的足细胞中Synapotopodin、Nephrin和PGC-1α的表达减低,抑制TGF-β1和线粒体损伤蛋白Cyto-c表达升高。⑵mi R-4645-3p显著改善高糖刺激导致的足细胞线粒体功能障碍和膜电位异常,并降低足细胞凋亡。4.mi R-4645-3p与Cdk5 m RNA 3’UTR区靶向结合⑴生物信息学分析结果显示mi R-4645-3p存在与Cdk5 m RNA 3’UTR区靶向结合的序列。⑵双荧光素酶报告基因结果显示在转染野生型Cdk5 3’UTR的细胞中,mi R-4645-3p的模拟物过表达抑制了荧光素酶活性。⑶过表达mi R-4645-3p显著抑制Cdk5基因表达。5.转染mi R-4645-3p对过表达Cdk5足细胞的影响⑴转染mi R-4645-3p mimics能显著逆转过表达Cdk5诱导的Synapotopodin,Nephrin和PGC-1α表达下调,TGF-β1和Cyto-c表达增强。⑵mi R-4645-3p显著减轻过表达Cdk5诱导的足细胞线粒体功能障碍和膜电位异常,有效改善Cdk5异常活化引起的足细胞损伤和凋亡。结论:1.高糖条件下,mi R-4645-3p在足细胞中的表达降低,过表达mi R-4645-3p有效减轻高糖诱导的足细胞损伤。2.mi R-4645-3p靶向调控Cdk5,通过抑制Cdk5缓解线粒体功能障碍和足细胞损伤。