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NAD(H)/NADP(H)作为电子传递载体参与生物体内众多氧化还原反应,在此过程中其总量保持不变。近些年研究发现NAD在众多细胞活动中具有重要的调控作用,此过程中NAD作为一些消耗酶类(如SRT和PARPs等)的底物被降解并释放出NIM等,因此生物体需要不断合成NAD(H)/NADP(H)以维持其体内平衡。NAD合成途径分为从头合成途径(De novo pathway)和补救合成途径(Salvagepathway)。在拟南芥体内,从头合成途径起始于天冬氨酸,经五步酶促反应最终生成NAD;补救途径是一个四步反应(NIM→NA→NaMN→NaAD→NAD,Preiss-Handler途径)。我们先前的研究表明,拟南芥NAD补救途径在响应NaCl和ABA胁迫时发挥重要作用,且过量积累的NA对植物细胞具有毒性。尼克酸磷酸核糖转移酶(Nicotinate phosphoribosyltransferase,NaPRTase,EC6.3.4.21)是补救合成途径的限速酶,但其在植物体内的生理功能以及在整个NAD代谢网络中的调控作用尚未见报道。在拟南芥基因组中,NaPRTase有两个编码基因:At4g36940(NaPRT1)和At2g23420(NaPRT2)。 本研究利用反向遗传学方法分析了AtNaPRTases的生化及生理功能。AtNaPRT1和AtNaPRT2氨基酸序列相似性高达88.19%,具有该类酶进化上保守的12个活性位点。体外生化表明,两个蛋白反应速率较快,特异地作用于NA,反应需要ATP,需要金属离子(Mg2+)。AtNaPRT1和AtNaPRT2在拟南芥全株表达,在胞质有定位信号。单突变体naprt1-1、naprt1-2和naprt2-1、naprt2-2在正常生长时,没有可见表型;通过单突变体杂交,我们未能获得纯合双突变体,表明两个基因功能冗余,且对植物体非常重要。一纯一杂突变体在营养生长阶段也没有可见表型,但后代基因型分离异常,比率为1∶1。与野生型回交,发现雄配子传递率异常,只有2.73%。在一纯一杂突变体中,用自身启动子分别驱动NaPRT1和NaPRT2全基因组序列可以互补雄配子败育这一表型,进一步说明是NaPRTase的功能缺失所致。通过限制授粉和转基因技术,我们也未获得纯合双突或理想的条件型双突株系。雄配子败育研究发现,一纯一杂突变体可以形成成熟的花粉粒,花粉活力和核质发育均正常,但是在体外萌发实验中,花粉超过半数不能正常萌发或者花粉管伸长异常,出现膨大甚至破裂的表型,最终导致无法获得双突变体。花和干花粉中NAD相关代谢物LC-QQQ-MS分析发现,naprt1-2中化合物变化甚微,naprt1-2/naprt1-2,naprt2-1/NaPR T2中化合物变化显著,具体表现为在花和干花粉中,产物NaMN、NaAD、NAD含量都出现不同程度降低;底物NA在花中显著积累,在干花粉中无差异,而NIM在干花粉中显著积累;在花中NA N-甲基化似乎是响应逆境的主要修饰方式,而在花粉中可能主要是NA糖基化。这表明naprt1-2/naprt1-2, naprt2-1/NaPRT2中花粉发育异常可能主要是由于干花粉中NAD含量降低;同时干花粉中NAD含量远远高于花中,暗示了花粉中特异的NAD代谢谱。随后14C-NIM饲喂结果也证实,不同于拟南芥其他组织,花粉中吸收的14C-NIM绝大部分都转化为NAD。鉴于在花粉中NAD从头合成途径中喹啉酸磷酸核糖转移酶转录本极低,故补救途径可能是供给NAD的主要途径。为了进一步揭示花粉败育的机理,分别对qrt1、naprt1-2、naprt1-2/naprt1-2,naprt2-1/NaPR T2的干花粉进行了RNA-Seq分析。差异表达基因的GO功能分析发现,naprt1-2/naprt1-2,naprt2-1/NaPRT2中生物过程(Biological process)、细胞组成(cellular component)和分子功能(Molecular function)三个部分均有上千个基因表达上调。差异表达基因的KEGG途径富集分析发现,与核糖体功能相关的101个基因显著上调,主生代谢途径(如糖酵解、TCA循环等)显著性富集上调,表明NaPRTase/NAD可能是通过对主生代谢酶蛋白水平的调控来保证花粉萌发过程中的能量供给,代谢稳态受到破坏可能是导致花粉败育的主要原因。