研究背景半乳糖凝集素(galectin)是凝集素超级家族的一个家族,属于β-半乳糖苷连接蛋白,对β-半乳糖苷有高度亲和性。迄今为止发现的半乳糖凝集素共有15种,并且都拥有一个或两个高度保守的糖识别域(carbohydrate cognition domain,CRD)。半乳糖凝集素-3(galectin-3)是galectin家族中唯一的嵌合型代表,拥有一个CRD和一个串联重复结构域。Galectin-3(gal-3)广泛表达于正常组织与肿瘤细胞,在细胞内合成,能够穿梭于胞浆和胞核,还可以转运到细胞膜上,能够调节肿瘤细胞的增值、迁移、凋亡、粘附和血管形成。Gal-3在大多数肿瘤细胞内呈现高表达,并且其表达水平与肿瘤的恶性程度存在着密切联系。近年来的研究表明,多数肿瘤患者血清中gal-3的浓度明显高于正常人,主要集中在乳腺癌、肺癌、口腔癌、胃癌、胰腺癌和结肠癌等患者。血清中的gal-3能够使MUC1极化分布,将细胞表面的粘附分子(cell adhesion molecules,CAMs)暴露出来,从而促进肿瘤细胞和血管内皮细胞之间的粘附。也有文献报道,gal-3的表达可诱导整合素的活化,从而促进肿瘤细胞与细胞外基质的纤连蛋白和层粘连蛋白的粘附。细胞粘附分子能够调节细胞与细胞之间和细胞与细胞外基质之间的粘附,在肿瘤细胞的侵袭转移过程中发挥重要的作用。E-钙粘蛋白(E-cadherin)能够与同型的E-cadherin结合,起到维持上皮细胞极性和完整性的作用,并且还参与调控肿瘤细胞的聚集,因此被广泛认为是肿瘤抑制因子,具有抑制肿瘤迁移的作用。而N-钙粘蛋白(E-cadherin)和CD44具有促进肿瘤细胞迁移的作用,也能够促进肿瘤的迁移和与血管内皮细胞之间的粘附。尤其是N-cadherin的表达也能够抑制E-cadherin调节的粘附作用,并且在引起肿瘤的侵袭和转移方面发挥着比E-cadherin的减少更为重要的作用。然而目前gal-3是否能够调控E-cadherin、N-cadherin和CD44等粘附分子的表达来促进肿瘤细胞的迁移?细胞外和细胞内的gal-3对这些粘附分子的调控作用以及对肿瘤侵袭转移的作用有何不同?目前这些调控机制尚未有文献报道。因此,本论文选用表达gal-3的非小细胞肺癌A549细胞和不表达gal-3的前列腺癌PC3细胞,分别研究细胞内和细胞外gal-3是否调控E-cadherin、N-cadherin和CD44的表达来影响肿瘤细胞的侵袭转移和粘附,调控机制如何?选用的这两种细胞均是MUC1低表达,从而避开MUC1对本论文中研究的gal-3调控粘附分子作用与机制的影响。研究方法和结果1.细胞内gal-3对粘附分子的调控及肿瘤侵袭转移的作用(1)采用siRNA技术干扰A549细胞内gal-3的表达后,采用Western blotting方法检测几种粘附分子的表达水平,结果发现E-cadherin、N-cadherin和CD44三种粘附分子的表达均明显降低,提示细胞内gal-3能够上调E-cadherin,N-cadherin和CD44的表达水平。(2)通过流式细胞术检测A549的聚集情况,结果发现细胞内gal-3对A549的聚集无明显影响。(3)采用siRNA技术干扰A549细胞gal-3的表达后,A549细胞与HUVECs之间的粘附能力明显降低。提示细胞内gal-3可促进肿瘤细胞A549与HUVECs细胞间的粘附。采用siRNA技术为探讨该作用的分子机制是否与β-catenin入核有关,通过胞浆、胞核分离提取法,并采用Western blotting检测A549细胞胞浆、胞核的β-catenin的变化,结果发现gal-3的siRNA组的β-catenin入核减少,提示细胞内gal-3可促进β-catenin入核。进一步采用β-catenin抑制剂ICG-001来确证β-catenin入核是细胞内gal-3促进A549细胞与HUVECs间粘附的关键因素,结果发现单用ICG-001可抑制两种细胞间的粘附,而在ICG-001存在下,干扰gal-3的基因表达后不再影响两种细胞间的粘附。说明gal-3可能是通过促进β-catenin入核调控粘附分子的表达,进而调控A549细胞与HUVECs间的粘附。(4)确定参与细胞内gal-3促进肿瘤细胞与血管内皮细胞间粘附作用的粘附分子种类及调控机制。上述结果已发现Gal-3可上调E-cadherin,N-cadherin和CD44的表达水平,那么三种粘附分子是否均参与了两种细胞间的粘附作用呢?首先,检测HUVECs细胞E-cadherin和N-cadherin的表达水平,发现HUVECs表达N-cadherin,但不表达E-cadherin。E-cadherin和CD44的配体是同型的cadherin分子,而CD44的配体是透明质酸,并且透明质酸几乎存在于所有细胞表面。提示gal-3促进A549细胞与HUVECs细胞间的粘附作用与上调E-cadherin的表达无关,而是与N-cadherin和CD44相关。接下来检测细胞内的gal-3与N-cadherin和CD44的调控关系。采用ICG-001阻断β-catenin的下游通路,并利用Western blotting方法检测N-cadherin和CD44的表达变化。结果显示,ICG-001能够使A549的N-cadherin的表达降低,但对CD44的表达无显著影响。但是在ICG-001的存在下,细胞内gal-3干扰后不再影响A549细胞中N-cadherin和CD44的表达,说明细胞内gal-3是通过β-catenin入核上调N-cadherin和CD44的表达,从而促进A549细胞与HUVECs之间的粘附作用。(5)采用划痕实验和transwell实验检测细胞内gal-3对A549细胞的迁移和侵袭能力的影响。本次试验分别观察单用gal-3 siRNA或10μM β-catenin抑制剂ICG-001组或两者合用后A549细胞的迁移和侵袭能力。而gal-3干扰组中和β-catenin抑制剂ICG-001组A549细胞的迁移能力也明显下降。两者合用组A549细胞几乎无明显的迁移能力。提示,阻断β-catenin/TCF基因转录能够增强干扰gal-3表达后抑制迁移的作用。促进β-catenin入核是gal-3促迁移作用的重要机制之一。2.细胞外的gal-3对粘附分子的调控及肿瘤侵袭转移的作用。(1)Gal-3通过EGFR介导可下调E-cadherin的表达。本课题组前期实验已经证明在EGF的存在下,细胞外的gal-3能够持续性激活表皮生长因子受体(EGFR),并使E-cadherin的表达降低。本论文中我们进一步检测细胞外gal-3调控E-cadherin表达的机制。在PC3细胞中加入EGF和gal-3共孵育1 h后,采用Western blotting实验检测相关蛋白的变化,结果发现细胞外gal-3可通过NF-κB相关信号通路下调PC3细胞内的E-cadherin的表达。(2)采用免疫共沉淀法检测E-cadherin/β-catenin复合体的变化,结果显示细胞外gal-3能够下调E-cadherin/β-catenin复合体的形成。(3)通过流式细胞仪检测PC3细胞的同型聚集情况,结果显示,在EGF的存在下,gal-3能够抑制PC3的聚集。(4)胞外gal-3能进入到细胞内,上调N-cadherin和CD44的表达,但不影响E-cadherin的表达。该实验是在无EGF的存在下,PC3细胞经gal-3处理0、1、2、4、8h之后,检测细胞内gal-3的表达水平,观察细胞外的gal-3能否进入细胞内;同时检测对E/N-cadherin和CD44的表达的影响,结果发现在2h时进入细胞的gal-3最多,之后逐渐下降。与此同时,E-cadherin的表达没有显著的变化,而N-cadherin和CD44在8h的时候表达最高。由于之前检测了 HUVECs细胞并不表达E-cadherin,细胞外的gal-3调控肿瘤细胞与HUVECs之间的粘附无需E-cadherin的参与。接下来的实验便不再加入EGF。(5)检测了细胞外的gal-3对A549和PC3细胞与HUVECs之间粘附的影响,结果显示,外加人重组的gal-3能够促进A549和PC3细胞与HUVECs间的粘附;同时能够上调N-cadherin和CD44的表达。(6)为了验证细胞外的gal-3是否内吞进入到细胞内并促进β-catenin的入核,采用胞浆、胞核分离提取法和western blotting实验检测胞浆、胞核的gal-3和β-catenin的变化。结果显示胞浆、胞核里的gal-3和β-catenin随着加入的gal-3浓度的增加而增加,说明细胞外的gal-3进入到细胞里面,进而促进β-catenin入核,调控N-cadehrin和CD44的表达。最后进一步确证了 N-cadherin和CD44参与gal-3促进的A549细胞与HUVECs间的粘附。采用siRNA干扰技术下调这两个粘附分子的表达后,结果显示N-cadherin表达的下调对A549细胞与HUVECs之间的粘附的影响大于CD44表达的下调所造成的影响。并且在这两个粘附分子表达下调之后加入了gal-3,结果显示干扰CD44组粘附能力恢复到接近空白对照组细胞的粘附能力。因此,N-cadherin在gal-3诱导的肿瘤细胞与HUVECs之间的粘附中发挥了比CD44更重要的作用。实验结论:1.细胞内的gal-3能够增加β-catenin入核上调N-cadherin和CD44的表达,从而促进A549细胞与HUVECs间的粘附。2.细胞内的gal-3对A549细胞间的同型聚集没有显著影响。3.细胞内的gal-3能够增加β-catenin入核促进A549细胞的侵袭和迁移。4.在EGF的存在下,细胞外的gal-3能够通过PI3K/P-Akt/NF-kB/ZEBl信号通路下调E-cadherin的表达,同时上调N-cadherin的表达,从而抑制PC3细胞的同型聚集。5.细胞外的gal-3能够进入细胞内,通过增加β-catenin入核促进N-cadherin和CD44的表达,但并不影响E-cadherin的表达。6.细胞外的gal-3能通过增加β-catenin入核促进肿瘤细胞与HUVECs之间的粘附。7.N-cadherin对gal-3诱导的粘附作用更优于CD44的作用。