论文部分内容阅读
研究背景:皮肤创面愈合有修复再生以及瘢痕愈合两种形式,其中瘢痕愈合后常在创口处留下大小不一的瘢痕疙瘩。瘢痕是临床常见的一种皮肤创口病理性纤维化愈合疾病,其发生主要与皮肤创口处成纤维细胞过度增殖相关,导致胶原蛋白、粘多糖等多种细胞外基质过度在创口处沉积,进而形成瘤样增生物。瘢痕组织对皮肤创口具有一定的填充作用,但对周围健康皮肤产生一定的侵袭作用,造成局部组织的畸形,可严重影响患者外形美观。转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是一种贯穿创伤愈合全过程的生长因子,其在瘢痕愈合中发挥了重要的作用。Parkin为稳定线粒体、调节有丝分裂以及拮抗氧化应激反应的重要因子之一,有学者指出Parkin可视为E3泛素化酶,具有降解多种蛋白底物的作用,监测其表达水平对预防瘢痕形成有重要的临床意义。目前尚无针对瘢痕疙瘩的有效治疗方法,手术虽然可有效清除瘢痕组织,但术后复发率较高。光动力疗法是治疗瘢痕的新型疗法,该方法具有无创和毒性低等特点已在临床得到广泛的应用。目的:本研究建立小鼠瘢痕模型,探究TGF-β3以及Parkin在瘢痕组织形成过程中的作用机制;通过开展分组对照实验,分析光动力抑制瘢痕形成中的效果。方法:1、收集在本院接受治疗的创伤后1-2年间形成、未接受治疗经病理检查证实为瘢痕疙瘩的标本6例。清理瘢痕疙瘩表面及基底部正常人体组织,选择1.0cm的内径环钻和手术刀切割瘢痕疙瘩,制备成直径1.0cm、高0.5cm的颗粒。选取40只成年健康小鼠制作小鼠瘢痕模型,将小鼠后背的毛发清理干净,选择小鼠背部正中线双侧1.5cm处,做1.5cm的纵向切口,切口深度达到小鼠背肌筋膜表面,将瘢痕颗粒置入切口,每个切口置入2粒,缝合2-3针。2、随机选取10只瘢痕模型小鼠皮肤瘢痕组织,在瘢痕颗粒植入3d、6d、9d、12d以及15d,分别取2只小鼠观察创口并利用H&E染色观察皮肤瘢痕组织病理学变化,采用免疫组织化学的方法检测瘢痕组织中TGF-β3蛋白的表达水平,进一步,通过免疫荧光染色观察皮肤瘢痕组织中Parkin蛋白和HIF-1α蛋白的表达水平。同时为了探究Parkin蛋白和HIF-1α蛋白的表达水平,我们采用了Westen Blot蛋白印记的方法检测了这两项指标。3、剩余30只模型小鼠均分为三组,对照组10只、实验A组10只、实验B组10只。在进行激光照射前用棉片湿敷生理盐水30min为对照组小鼠瘢痕组织进行处理,实验A组利用棉片湿敷10%的氨基酮戊酸溶液处理小鼠瘢痕组织30min,实验B组用棉片湿敷20%的氨基酮戊酸溶液处理小鼠瘢痕组30min。3组小鼠进行统一的光照射,波长635nm,功率密度100J/cm~2,光斑直径1cm,照射时长20min/d,共计32天,模型建立后,通过H&E和Masson染色观察光动力对皮肤瘢痕组织病理部位的影响,并计算瘢痕指数。结果:1、建立动物模型后第9d创面浅侧部位实现完全再生,第12d创面深侧部位开始出现上皮化,第15d表现为瘢痕增厚。2、镜下观察结果,正常皮肤组织表面被覆鳞状上皮,表皮细胞规则排列,真皮乳头层细胞排列较整齐,皮肤附属器结构完整,成纤维组织成网状结构。正常瘢痕组织表面被覆由鳞状上皮,伴有少量角化过度,棘层细胞略增厚在真皮层内大量纤维组织增生,部分胶原化,仅见少量皮肤附属器。病理性瘢痕组织表面被覆鳞状上皮,真皮乳头部分细胞消失或出现延长,真皮层内大量纤维组织增生,呈旋涡状、束状排列或交错纵横分布,胶原纤维束粗大,玻璃样变,仅见少量或未见皮肤附属器。3、TGF-β3在创面愈合早期即开始在浅侧部位表达,9d即达到峰值,12d后降低;创面愈合中期(6d)开始在深侧部位表达,12d达到峰值,15d后降低,深侧部位TGF-β3表达峰值显著高于浅侧部位。4、Westen Blot和免疫组化结果提示,与正常的皮肤组织相比瘢痕组织中Parkin蛋白表达水平显著降低,而HIF-1α蛋白的表达水平呈升高趋势。5、动物模型建立后10周(2次光照治疗后2周),实验B组模型小鼠瘢痕萎缩程度、硬度降低程度以及充血改善情况均显著优于其他2组,镜下观察实验组模型小鼠瘢痕组织细胞核膜呈现萎缩改变,细胞浆内存在大量的空泡,胞体体积增大明显,纤维束大量增加。6、动物模型建立后6周,3组模型小鼠瘢痕指数比较无明显差异(P>0.05);建立后10周(2次治疗后2周)以及14周(3次治疗后2周),实验B组瘢痕指数显著小于实验A组小于对照组,差异显著(P<0.05);动物模型建立后6周、10周、14周,3组模型小鼠瘢痕指数均存在降低趋势,差异显著(P<0.05)。7、动物模型建立后6周、10周(2次治疗后2周)、14周(3次治疗后2周),3组模型小鼠瘢痕组织成纤维细胞数量呈降低趋势(P<0.05);同一时间内,实验B组瘢痕组织成纤维细胞数量显著小于实验A组小于对照组,差异显著(P<0.05)。结论:1、小鼠浅侧创面可实现完全再生,而深侧创面愈合方式主要以瘢痕愈合为主。2、TGF-β3在深侧创面愈合中晚期具有调控组织重建以及调控瘢痕组织形成的作用。3、在小鼠瘢痕组织中Parkin蛋白表达呈下降低趋势,而HIF-1α蛋白的表达呈现升高的趋势,说明二者对在瘢痕组织中起到一定的调节作用。4、20%的氨基酮戊酸可在光动力作用下对瘢痕组织产生毒作用,进而抑制瘢痕疙瘩的生成。